1.Если клетки растут в монослойной культуре, то снимите их с подложки, заменив культуральную среду на раствор трипсин-ЭДТА* в физиологическом фосфатном буфере (ФСБ)**. Затем проинкубируйте их при комнатной температуре в течение минимального времени, необходимого для отделения клеток от подложки, обычно оно составляет 5—15 минут.

2.Отцентрифугируйте клетки и ресуспендируйте их в достаточном объеме ФСБ, чтобы получить концентрацию порядка 106 клеток на мл.

3.Смешайте небольшой объем суспензии клеток с 2,5 объемами рабочего раствора ФДА *** — это даст вам конечную концентрацию его около 0,1 мкг/мл.

4.Заключите каплю суспензии под покровное стекло и замажьте края силиконовой смазкой.

5.Просмотрите препарат под флуоресцентным микроскопом или в условиях темного поля с лампой накаливания, используя интерференционный фильтр.

Результаты. Живые клетки немедленно дадут яркую зеленую флуоресценцию, интенсивность которой будет возрастать со временем. Поврежденные или мертвые клетки не окрасятся.

Контроль. Поскольку некоторые популяции клеток содержат аутофлуоресцентный материал, то необходимо сделать препарат без ФДА. Возможные трудности. Если клетки вообще не светятся, то сделайте другой препарат, принимая все меры предосторожности, чтобы избежать механических повреждений.

*Приготовьте раствор трипсин-ЭДТА из 0,05% (вес на объем) трипсина и 0,003% (вес на объем) ЭДТА, растворенных в ФСБ.

**Приготовьте ФСБ, растворив в воде

0,2 г КС1,

0,2 г КН2РО4,

8 г NaCl,

1,15 г Na2HPO4,

раствор довести до 1 л.

*** Приготовьте 0,1%-ный исходный раствор ФСБ в ацетоне. Чтобы приготовить рабочий раствор, разведите 1 объем этого раствора в 4000 объемах ФСБ. Рабочий раствор должен быть прозрачным (не иметь молочного оттенка) и без осадка.

I. Проверка жизнеспособности культивируемых клеток. Прежде чем начинать работу с культурой клеток,

часто бывает необходимо определить в ней долю живых клеток. Один из общепринятых способов состоит в обработке клеток флуоресцеиндиацетатом (ФДА). Благодаря своей гидрофобности это нефлуоресцирующее вещество легко проникает через интактную плазматическую мембрану живых клеток. Под действием лизосомных эстераз ФДА гидролизуется с образованием флуоресцентного красителя — флуоресцеина. Это ионное и, следовательно, гидрофильное вещество накапливается в клетках, так как оно не может пройти через гидрофобную липидную мембрану. В мертвых или поврежденных клетках флуоресцеин либо не образуется совсем, либо выходит через поврежденную мембрану в инкубационную среду. Подробнее данный метод выявления живых клеток описан в табл. 5.18.

3.3. Морфологические исследования

Используемые для выявления морфологии маркеры опять-таки могут быть химической или биологической природы; механизмы окраски соответственно варьируют и могут включать как физико-химические, так и биологические процессы. Такие методы применяются для:

1)прослеживания нейронных связей путем наблюдения за аксонным транспортом флуорохромов;

2)определения межклеточных пространств в расщелинах между эпителиальными клетками с помощью негативного окрашивания;

3)изучения трехмерного распределения лимфоцитов различных классов в фолликулах лимфоузлов.

I. Выявление канальцев и лакун внутри кости. Остеоциты и их отростки располагаются внутри полостей в матриксе кости. Первая стадия данного метода состоит в неспецифическом окрашивании всех элементов ткани тионином, катионным красителем, который прочно связывается с белками при щелочных значениях рН. Затем следует короткая экспозиция в анионном красителе — пикриновой кислоте, которая попадает только в наиболее проницаемые места, в частности в полости. В них откладывается слабо растворимая соль — пикрат тионина. Поверхностные отложения затем удаляются с помощью дифференцировки водным раствором этанола.

Методика окраски приведена в табл. 5.19.

109