LIGHT MICROSCOPY IN BIOLOGY

A PRACTICAL APPROACH

Edited by Alan J. Lacey

Department of Biology and Biochemistry, Brunei, The University of West London, Uxbridge, Middlesex UBS 3PH, UK IRL Press

Oxford University Press

Oxford New York Tokyo

СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ В БИОЛОГИИ: МЕТОДЫ

Под редакцией А. ЛЕЙСИ

Перевод с английского д-ра биол. наук И. А. ВОРОБЬЕВА Москва «Мир» 1992

Авторы: Брэдбери С. Дж., Эвеннет П. Дж., Хоробин Р. В.„ Имре С. Ф., Лейси А., Мейл В., Ормерод М. Г., Плозм И. С., Самнер А. Т., Вейс Д. Г., Уик Р. А.

Световая микроскопия в биологии. Методы: Пер. с англ./Под ред. А. Лейси.—М.: Мир, 1992. — 464 с.

Руководство по использованию современных методов световой микроскопии, написанное международным коллективом авторов (Великобритания, ФРГ, США). Описаны принципы просвечивающей световой микроскопии, методы фазового и интерференционного контраста, наблюдения в поляризованном свете, флуоресцентная микроскопия, микрофотометрия и анализ изображения, видеомикроскопия.

Книга относится к зарекомендовавшей себя серии «Методы», издаваемой IRL Press.

Для студентов и специалистов — биологов и медиков, работающих со световым микроскопом.

© IRL Press at Oxford University Press 1989

This book was originally published in the English language by IRL Press Limited, which is now part of Oxford University Press, Oxford, England

© перевод на русский язык, Воробьев И. А., 1992

ПРЕДИСЛОВИЕ ПЕРЕВОДЧИКА

В течение последних 200 лет световая микроскопия является основным инструментом для исследователей, работающих в области цитологии, гистологии, эмбриологии и многих других биологических дисциплин, причем в последние десятилетия ее применение неуклонно расширяется. Сейчас трудно представить себе современную биологическую или медицинскую лабораторию, где бы не стоял световой микроскоп. В то же время значительная часть огромной армии исследователей, работающих с микроскопом, весьма смутно представляет себе теоретические основы и практические возможности метода. Поэтому предлагаемая читателям книга должна стать необходимым пособием для тех, кто хочет не просто «смотреть в микроскоп», но и получать с его помощью достоверные результаты.

Цель сборника — познакомить читателей с основами оптической микроскопии и некоторыми ее практическими приложениями в области биологии и медицины. Следует подчеркнуть, что книга не является пособием для начинающих. Она скорее адресована людям, которые уже имеют опыт практической работы (быть может, не всегда успешной). Основное достоинство книги в том, что в ней хорошо и достаточно просто изложены теоретические основы методов, которыми широко пользуются многие специалисты в различных лабораториях. Ее особая ценность для нас обусловлена и почти полным отсутствием аналогичной литературы на русском языке. Последние сколько-нибудь подробные пособия по микроскопии были изданы в СССР в конце 60-х — начале 70-х годов, и, разумеется, как практические руководства они значительно устарели.

Главы 1 и 2 посвящены описанию настройки освещения по Кёлеру и пределам возможностей световой микроскопии. Конечно, не все проблемы микроскопии освещены в книге с равной степенью полноты. Так, мало внимания уделено темнопольной микроскопии высокого разрешения, которая в настоящее время, при наличии мощных источников света, позволяет исследовать очень мелкие объекты, такие, как отдельные микротрубочки, бактериальные жгутики и т. д.

В главах 2, 3, 6, 7 и 8 рассматриваются отдельные методы микроскопии. Разумеется, читателю следует помнить, что книга ориентирована на зарубежного исследователя и соответственно на технические проблемы и возможности лабораторий Западной Европы, США и Японии. Именно этим объясняется столь подробное рассмотрение проблем цветной фотомикрографии, которая в России почти не применяется. Наша промышленность не выпускает иммерсионных флуоресцентных объективов современных типов (Планахромат,

Планапохромат, Планнеофлуар), без которых практически невозможна флуоресцентная микроскопия высокого разрешения. Желающих приобрести такие объективы за рубежом не должна останавливать чрезмерно высокая стоимость этой оптики (для сравнения, стоимость одного Планапохромата примерно вдвое выше, чем персонального компьютера), так как качество получаемого с их помощью первичного изображения может полностью оправдать затраты.

Следует особо отметить главу 8, где авторы впервые в руководствах подобного типа подробно рассматривают такую совершенно новую и бурно развивающуюся (в методическом плане) область, как видеомикроскопия. За время, прошедшее с момента написания книги (1989 год), в этой области произошли заметные сдвиги, связанные главным образом с развитием микроэлектроники. Так, почти вышли из употребления дигитайзеры, уступив место телекамерам. По-видимому, уходят в прошлое специализированные видеосистемы, так как необходимые для работы в реальном времени мощные видеопроцессоры стали теперь компактнее и размещаются внутри персональных компьютеров. Например, разработанная в 1989 году устанавливаемая в персональный компьютер плата PCoeil французской фирмы Electronique Lyonnaise по своим возможностям аналогична описываемой в книге системе ARGUS-100 Hamamatsu, а стоит почти в 10 раз дешевле. Появилась и широко распространяется в мире система присоединяемых к персональным компьютерам оптических дисков однократной записи (емкостью до 2 Гигабайт), которые позволяют записывать изображение без потери качества, неизбежной при использовании видеомагнитофонов, и в реальном времени (т. е. со скоростью 25 или 30 кадров в секунду). Выпуск систем для телевизионного ввода изображения начат в настоящее время и у нас, причем цены на них, как и во всем мире, снижаются.

Несколько особняком стоят главы 4, 5 и 9, полностью посвященные описанию гистохимических, цитохимических и иммунохимических методов окраски. Они представляют собой скорее введение в проблемы, и читателям, всерьез заинтересованным в освоении данных методов, следует обратиться к более подробным руководствам.

Предлагаемый читателям сборник не охватывает, разумеется, всех аспектов применения световой микроскопии, но он позволяет заложить хорошие основы для самостоятельной исследовательской работы со световым микроскопом.

Я. А, Воробьев

ПРЕДИСЛОВИЕ

Эта книга призвана служить практическим руководством для исследователей, стремящихся шире использовать возможности своих микроскопов, а также для тех, кто, может быть, впервые попытался воспользоваться микроскопом в своей работе.

Микроскоп позволяет исследователю видеть тонкие детали строения объектов и фиксировать результаты. Можно, кроме того, использовать микроскоп для измерения образцов. Сравнительно недавно были разработаны методы, позволяющие на основании взаимодействия света с веществом определять такие параметры, как коэффициент преломления, масса и химический состав мелких объектов. Наконец, многократная запись измерений через определенные промежутки времени позволяет исследовать в микроскопических препаратах движение и другие изменения.

Для того чтобы наблюдать мелкие детали, микроскопист должен получить определенное увеличение, разрешение и контрастность. Необходимо помнить, что в микроскопе наблюдатель видит увеличенную репродукцию объекта. В искусстве к репродукциям относятся с большой осторожностью, и мы надеемся, что в этой книге методы микроскопии рассмотрены достаточно подробно, чтобы исследователям стала понятна необходимость осторожного и критического подхода к наблюдениям.

Световой микроскопии уже более 200 лет, и ее методы развивались по мере роста потребностей. Совершенствование как приборного, так и программного обеспечения стимулировало новые исследования. Последние достижения в микроскопии — это автоматическая запись результатов и автоматический анализ изображения.

При всех способах микроскопии основной этап, или основное искусство, — это получение хорошего изображения, т. е. достижение оптимального увеличения, разрешения и контраста. Результаты любого анализа изображения зависят от качества исходного изображения. Таким образом, для каждого исследования, проводится ли оно с помощью визуального наблюдения или с использованием автоматических телевизионных систем, необходим хороший микроскоп. Цена хорошего микроскопа довольно высока (она иногда сравнима с ценой электронного микроскопа), но это инструмент, с помощью которого создается первичное изображение, поэтому затраты на него оправданы. Функции электронного и светового микроскопов различны, но световой микроскоп имеет то преимущество, что он позволяет получать информацию о живых объектах в реальном времени, благодаря чему он может применяться в различных отраслях биологии.

В главе 1 объясняется, как получить правильное освещение препарата, и зачем это нужно. Глава 2 посвящена описанию общих принципов и некоторых простых экспериментов, иллюстрирующих пределы возможностей световой микроскопии. Последующие главы посвящены фиксации изображений, полученных с помощью различных методов освещения. В главах 4 и 6 описывается применение красителей в гистохимии и подчеркивается специфичность, достигаемая с помощью иммунофлуоресцентных методов окраски. Посвященная исследованиям хромосом глава 9 иллюстрирует те возможности, которые возникают при

2

комбинировании различных методик. В главе 8 описано необходимое оборудование и даны инструкции по применению видеомикроскопии для улучшения качества изображения. В этой же главе критически (по крайней мере отчасти) обсуждаются рассмотренные в первых главах представления о контрасте, разрешающей способности и достаточном увеличении. В ней вновь подчеркивается, что главное в световой микроскопии достижение наивысшего качества первичного изображения.

Я хотел бы особо поблагодарить проф. А. Кертиса за его участие в написании раздела по интерференционной отражательной микроскопии в гл. 2. Доктор Питер Игле из Королевского колледжа в Лондоне предоставил мне возможность познакомиться с работой видеомикроскопической установки и помог отредактировать посвященную этому методу главу. Я благодарен также многим из авторов настоящей книги, когда-то обучавшим меня микроскопии, и тем, кто позднее показывал мне возможности микроскопической техники в различных областях биологии. Я приношу глубокую благодарность издателям за их терпение и участие в изготовлении рисунков и подготовке рукописи.

Наконец, я хотел бы поблагодарить сотрудников департамента биологии Брунельского университета за помощь, которую они оказали мне при работе с текстовым редактором.

АВТОРЫ

S. J. Bradbury, Department of Human Anatomy, University of Oxford, South Parks Road, Oxford OX1 3QX, UK P. Evennett, Department of Pure and Applied Zoology, University of Leeds, Leeds LS2 9JT, UK

R.W. Horobin, Department of Biomedical Science, University of Sheffield, Sheffield S102TN, UK

S.F. Itnrie, Institute of Cancer Research, Royal Cancer Hospital, The Haddow Laboratories, Clifton Avenue, Sutton, Surrey SM2 5PX, UK

A.J. Laceу, Department of Biology and Biochemistry, Brunei, The University of West London, Uxbridge, Middlesex UBS 3PH, UK

W.Maile, Institut fur Zoologie, Technische Universitat Munchen, Lichten-bergstrasse 4, D-8046 Garching, FRG

M.G. Ormerod, Institute of Cancer Research, Royal Cancer Hospital, The Haddow Laboratories, Clifton Avenue, Sutton, Surrey SM2 5PX, UK

J.S. Ploem, Department of Histochemistry and Cytochemistry, Sylvius Laboratories, University of Leiden, Leiden, The Netherlands

A.T. Sumner, MRC Human Genetics Unit, Western General Hospital, Crewe Road, Edinburgh EH4 2XU, UK

D.G. Weiss, Institut fur Zoologie, Technische Universitat Munchen, Lichten-bergstrasse 4, D-8046 Garching, FRG R, A. Wick, Photonic Microscopy Inc., 2625 Butterfield Road, 204 South Oak Brooks, IL 60521, USA

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ