2 курс / Биохимия / Тканевая биохимия

УДК 577.1(076.5)

Тканевая биохимия : учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биологической химии для студентов лечебного факультета ; изд. 3-е, перераб. и доп. / под ред. проф. В.А. Дадали, доц. М.Н. Смертиной. – СПб. : Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2013. – 116 с.

Составители:

сотрудники кафедры биологической и общей химии СЗГМУ им. И.И. Мечникова О.А. Агафонова, Ч.Р. Бейшебаева, Н.Э. Голованова,

Н.К. Зайцева, Л.В. Иванова, В.Г. Макаров, Р.Н. Павлова, М.Н. Смертина

Учебно-методическое пособие предназначено для студентов лечебного факультета медицинских вузов, выполняющих практические занятия по курсу биологической химии. В пособии перечислены компетенции, в освоении которых необходимы знания биологической химии, сформулированы цель и мотивация каждой темы, представлены вопросы для самоподготовки, основная и дополнительная литература к каждой теме, методика проведения практической работы, клинико-диагностическое и медикопрофилактическое значение определяемых показателей. После каждой темы приведены обучающие тесты с ответами. Часть занятий изложена в виде ситуационных задач, для решения которых студенты пользуются дополнительной литературой, предлагаемой на занятии.

Рецензент: д-р биол. наук проф. А.Т. Марьянович.

Утверждено в качестве учебно-методического пособия методическим советом ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова, протокол № 3 от 01 марта 2013 г.

Тема 1. ХИМИЯ КРОВИ. ОБМЕН ХРОМОПРОТЕИНОВ

Место проведения: кафедра биохимии. Продолжительность занятия – 180 мин.

Цель занятия: изучить химический состав, физико-химические свойства и функции крови, строение, свойства и роль отдельных хромопротеинов в обмене веществ человека; овладеть методом определения содержания общего билирубина в сыворотке крови человека с интерпретацией полученных результатов в целях диагностики патологических состояний.

Изучение данной темы направлено на формирование у студентов следующих компетенций: ОК-1, ОК-3, ОК-5, ПК-2, ПК-3, ПК-5, ПК-8,

ПК-15, ПК-16, ПК-17, ПК-18.

Конкретные задачи.

Студент должен знать:

–химический состав и физико-химические свойства и функции крови;

–строение миоглобина, гемоглобина и их производных;

–синтез и распад гемоглобина;

–врожденные и приобретенные нарушения синтеза и распада гемоглобина;

–диагностическое значение определения билирубина в сыворотке крови.

Студент должен уметь:

–исходя из особенностей строения хромопротеинов, уметь прогнозировать их физико-химические свойства и функции;

–предлагать способы профилактики и коррекции метгемоглобинемий, в том числе с использованием природных соединений;

–оценивать и интерпретировать результаты клинических и биохимических анализов крови.

Студент должен владеть: навыками прогнозирования физикохимических свойств, исходя из особенностей строения хромопротеинов; навыками определения содержания общего билирубина в сыворотке крови; навыками оценки и интерпретации клинических и биохимических анализов крови.

Мотивация. Знания и навыки, приобретенные на занятии, необходимы для своевременной и дифференциальной диагностики заболеваний крови и печени, для лечения больных, для обоснования и внедре-

3

ния в практику мер профилактики патологических состояний и заболеваний, например метгемоглобинемий, гипербилирубинемий, гепатитов.

Межпредметные связи

коферменты

Вопросы для самоподготовки

1.Химический состав крови и физико-химические свойства крови.

2.Классификация и функции белков крови.

3.Строение, свойства, функции хромопротеинов, включая строение, свойства, функции миоглобина и гемоглобина.

4.Дыхательная функция крови.

5.Нормальные и патологические производные гемоглобина, механизм их образования.

6.Механизм образования метгемоглобина и реакции восстановления метгемоглобина.

4

7.Метгемоглобинемии: классификация, принципы лечения.

8.Гемоглобинопатии: причины возникновения, особенности патогенеза на примере серповидно-клеточной анемии.

9.Талассемии: причины возникновения, особенности патогенеза.

10.Синтез гема. Механизмы ингибирования ключевых ферментов.

11.Порфирии: причины возникновения, особенности патогенеза, диагностика.

12.Распад гемоглобина: локализация отдельных этапов, образование желчных пигментов.

13.Принцип метода определения общего билирубина в сыворотке

крови.

14.Прямой и непрямой билирубин: образование, строение, свойства.

15.Диагностическое значение определения общего билирубина в сыворотке крови, гипербилирубинемии: виды, дифференциальные признаки.

Задания для самоподготовки

1.Изучить рекомендуемую литературу, используя вопросы для самоподготовки.

2.Составить и написать в рабочей тетради схему синтеза гема, указать ферменты, чувствительные к действию ингибиторов.

3.Составить и написать в рабочей тетради схему распада гемоглобина, выделив этапы распада, обезвреживания билирубина, образование желчных пигментов в норме и при различных патологических состояниях.

4.Составить и оформить в тетради таблицу: сравнительная характеристика форм билирубина.

5.Составить и оформить в рабочей тетради таблицу по дифференциальной диагностике желтух.

6.Составить и оформить в рабочей тетради таблицу по дифференциальной диагностике гипербилирубинемий.

7.Написать в рабочей тетради роль уридиндифосфатглюкуроновой кислоты (УДФГТ) в метаболизме билирубина и других эндогенных и экзогенных соединений, включая лекарственные препараты.

8.Рассмотреть роль индуктора фенобарбитала в диагностике и лечении гипербилирубинемий.

5

Рекомендуемая литература

Основная

Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М. :

Медицина, 1998. – С. 77–84, 590–593, 610–614, 628–637.

Биохимия : учебник для вузов / под ред. проф. Е.С. Северина. – М. :

ГЭОТАР-МЕД, 2005. – С. 45–55, 636–664; То же. – 2011. – С. 45–55, 623–673.

Дополнительная

Кольман, Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К. Рем. – М. : Мир, 2000. –

С. 194–196, 268–284.

Марри, Р. Биохимия человека ; т. 1 / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес,

В. Родуэлл. – М. : Мир, 1993. – С. 52–62, 356–372.

Цыганенко, А.Я. Клиническая биохимия / А.Я. Цыганенко [и др.]. – М. :

Триада-Х, 2002. – С. 148–156.

Пример входного контроля

1.Гемсодержащие ферменты: строение, свойства, функции. Примеры гемсодержащих ферментов.

2.Что такое прямой билирубин и непрямой билирубин сыворотки крови, место их образования и диагностическое значение.

Список терминов

Хромопротеины – группа «цветных белков» сложного строения, небелковая часть которых определяет наличие окраски.

Гемопротеины – группа сложных белков, небелковая часть которых представлена гемом.

Гемоглобинопатия – врожденное нарушение первичной структуры гемоглобина А.

Талассемия – врожденное нарушение синтеза α- или β-цепей гемоглобина А.

Порфирия – наследственное и приобретенное нарушение синтеза гема. Гипербилирубинемия – повышенное по сравнению с нормой содержа-

ние общего билирубина в крови.

Метгемоглобинемия – состояние, при котором содержание метгемоглобина в крови превышает 3 %.

Клинико-диагностическое значение определения метгемоглобина в крови

Метгемоглобин образуется в результате реакции окисления железа

в геме гемоглобина, HbFe+2 е MetHbFe+3, то есть метгемоглобино-

6

образование идет под действием любых веществ с дефицитом е͞.Этому способствует изменение конформации белковой части молекулы гемоглобина вследствие окисления ряда функциональных групп белка. В крови здорового человека содержание метгемоглобина не более 3 %, что достигается равновесием между реакциями его образования и реакциями восстановления метгемоглобина. Из реакций восстановления наиболее значимыми являются следующие:

НАДФН+Н+ НАДФ+

НАДФН зависимая

MМeHt b-редуктаза

причем НАДФН+Н+ образуется в ключевых реакциях ПФЦ.

НАДН+Н+ НАД+

НАДН зависимая MetМ Hbb-редуктаза

причем НАДН+Н+ образуется в ключевых реакциях гликолиза.

Данная реакция является неферментативной. Если содержание метгемоглобина в крови превышает 3 % – это называется метгемоглобинемия. Метгемоглобинемии делятся на врожденные и приобретенные. Врожденная метгемоглобинемия имеет место при энзимопатиях и гемобинозах. Энзимопатии – генетически обусловленные нарушения синтеза ключевых ферментов, участвующих в восстановлении МеtHb или ключевых ферментов ПФЦ, генерирующих восстановленный НАДФН. Гемоглобинозы делятся на гемоглобинопатии – генетически обусловленные нарушения строения белковой части Hb, возникающие в результате точечных мутаций, и талассемии – состояния, развивающиеся в результате генетически обусловленного снижения синтеза какой-либо из цепей Hb.

Приобретенные метгемоглобинемии делятся в зависимости от причины на эндогенные и экзогенные. Эндогенная метгемоглобинемия может возникать при различных патологических состояниях или заболева-

7

ниях, которые сопровождаются недостаточностью АОС (например, хронический энтерит, хронический гепатит, сахарный диабет и другие).

Экзогенная метгемоглобинемия возникает в случае избыточного поступления в организм человека окислителей, в том числе и лекарственных препаратов со свойствами окислителей. Так как MetHb теряет способность транспортировать О2, метгемоглобинемия сопровождается признаками гемической гипоксии, которые обусловлены различными нарушениями в обмене веществ. Для профилактики и лечения осложнений необходимо контролировать уровень MetHb в крови.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Количественное определение общего билирубина в сыворотке крови по методу Ендрассика и Клехгорна

Цель работы: ознакомиться с методом количественного определения общего билирубина в сыворотке крови.

Мотивация. Билирубин – продукт ферментативного окисления гемоглобина (конечный продукт распада гема), образующийся в результате естественного распада эритроцитов в клетках РЭС, относится к группе желчных пигментов. Билирубин – вещество токсичное, так как молекула билирубина является гидрофобной и может проникать в клетки головного мозга. Поэтому в организме человека существует реакция обезвреживания билирубина, которая протекает в печени:

2УДФГК 2УДФ Билирубин билирубиндиглюкуронид ,

УДФГТ

где УДФГК – кофермент уридиндифосфатглюкуроновая кислота, УДФГТ – фермент уридиндифосфатглюкуронилтрансфераза.

Билирубиндиглюкуронид экскретируется с желчью в ЖКТ, где высвобождается из конъюгата, восстанавливается до уробилиногена, затем превращается в стеркобилиноген, в форме которого и выводится из организма человека.

Принцип метода: в основе определения билирубина лежит реакция азосочетания билирубина с диазосмесью Эрлиха, в результате которой появляется малиново-красная окраска за счет образующегося азобилирубина. Концентрация последнего определяется фотоколориметрически.

8

Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно (прямой билирубин по старой терминологии), тогда как свободный билирубин неустойчив в растворе в сильнокислой среде, при которой происходит реакция азосочетания, и требует присутствия стабилизатора, роль которого могут играть кофеин, спирт, мочевина, ацетат, бензонат натрия и др. (непрямой билирубин).

Ход работы. В химическую пробирку отмеривают 1 мл сыворотки и 2,5 мл кофеинового реактива. Диазосмесь готовят в одной пробирке на всю группу следующим образом: 10 мл 0,5 % раствора сульфаниловой кислоты и 0,25 мл 0,5 % нитрита натрия отмеривают пипеткой в стеклянный стакан. Готовую диазосмесь отмеривают пипеткой по 0,5 мл в каждую пробу с сывороткой. Содержимое пробирки перемешивают и ставят на 20 мин в темноту, затем фотометрируют с зеленым светофильтром (длина волны 530 нм) в кюветах 10 мм против контрольной пробы, в которой вместо сыворотки используют 1 мл дистиллированной воды.

Расчет проводят по формуле:

Х = [(6,34 ∙ D) – 0,05] ∙ 17,1 = _______ мкмоль/л,

где D – оптическая плотность; 0,05 – поправка на окраску диазосмеси с кофеиновым реактивом; 17,1 – коэффициент перерасчета в единицах СИ.

Выводы: _________________________________________________.

Клинико-диагностическое значение определения общего билирубина в сыворотке крови

В крови здорового человека уровень общего билирубина равен 8,5– 20,5 мкмоль/л (0,4–0,8 мг/дл), причем около 75 % этого количества приходится на долю непрямого билирубина (6,4–15,4 мкмоль/л).

Повышение содержания общего билирубина более 20,5 мкмоль/л называется гипербилирубинемией и является симптомом различных физиологических и патологических состояний. Гипербилирубинемия более 30–35 мкмоль/л сопровождается желтушной окраской склер и кожных покровов.

Физиологическая гипербилирубинемия – это так называемая неонатальная физиологическая желтуха новорожденных. Общий билирубин повышен за счет неконъюгированного (непрямого) билирубина, что

9

является следствием, с одной стороны, интенсивного гемолиза эритроцитов, содержащих фетальный гемоглобин (НbF), а с другой стороны, следствием незрелости гепатоцитов по захвату, конъюгации и экскреции конъюгированного билирубина.

Патологическая гипербилирубинемия может быть вызвана различными причинами, например:

–гемолитическая гипербилирубинемия (гемолитическая желтуха) является следствием массивного гемолиза эритроцитов. Общий билирубин повышен за счет неконъюгированного (непрямого) билирубина при возможном повышении и конъюгированного (прямого) билирубина. В свою очередь, причины гемолиза делятся на биологические (малярия, переливание крови, не совместимой по группе или резус-фактору) и химические (действие сильных окислителей и других тиоловых ядов, врожденные заболевания с гемолизом, например гемоглобинопатии (серповидно-клеточная анемия) и энзимопатии (в частности по глюко- зо-6-фосфатдегидрогеназе и метгемоглобинредуктазе);

–врожденная неконъюгированная гипербилирубинемия (врожденная негемолитическая желтуха) является следствием метаболического дефекта в конъюгации билирубина за счет отсутствия или крайней низкой активности УДФГТ, что наблюдается при синдроме Клиглера– Найяра и синдроме Жильбера. Общий билирубин повышен за счет неконъюгированного (непрямого) билирубина;

–токсическая гипербилирубинемия (паренхиматозная желтуха) является следствием поражения клеток печени вирусами (вирус гепатита А, В, С, D, цитомегаловирус), гепатотропными ядами (хлороформ, четыреххлористый углерод, трихлорэтилен, галотан, ацетаминофен (парацетомол), изониазид, рифампицин, α-аманитин (токсин бледной поганки) и др.), а также имеет место при циррозе печени (синдром гепатоцеллюлярной недостаточности). Общий билирубин повышен преимущественно за счет неконъюгированного (непрямого) билирубина. Конъюгированный (прямой) билирубин может быть в пределах нормы или повышен (при цитолизе);

–конъюгированная гипербилирубинемия (обтурационная, холестатическая желтуха) является следствием механического препятствия оттоку желчи, что наблюдается при желчнокаменной болезни (калькулезный холецистит) и при наличии опухоли, перекрывающей желчевыводящие пути (опухоль главного желчевыводящего протока, опухоль головки поджелудочной железы и др.). Общий билирубин повышен за счет конъюгированного (прямого) билирубина;

10