2 курс / Биохимия / Н.Ю.Коневалова - Биохимия

1.2. Механизмы репликации

Репликация ДНК у прокариот и эукариот в общих чертах схожа. Однако, у эукариот этот процесс более сложен и менее изучен. Поэтому в изложении материала будем опираться, в основном, на процессы, происходящие у прокариот.

Репликация условно подразделяется на 3 стадии:

1.Инициация

2.Элонгация

3.Терминация

Инициация. Необходимые компоненты: Инициаторный белок, ДНК-хеликаза, ДНК-гираза, ДНК-стабилизирующий белок (SSBбелок), полный набор рибонуклеотидов, праймаза, АТФ.

«шпильки»

SSB-белки

препятствуют образованию водородных связей

Инициаторный белок обнаруживает на молекуле ДНК точки начала репликации и связывается с ними. Такие точки встречаются по всей длине молекулы ДНК. Для их функционирования необходима определенная последовательность состоящая из 11 нуклеотидов ((А или Т) ТТТАТ (А или Г) ТТТ (А или Т)). Она получила название консенсусной последовательности. К инициаторному белку присоединяется ДНК-хеликаза. Этот фермент обладает АТФ-азной активностью. Он разрывает водородные связи между комплементарными нуклеотидами и расплетает ДНК. На разрыв водородных связей одной компле-

лившимися цепями ДНК и в каждой отдельной цепи препятствует образованию «шпилек». В результате по всей длине ДНК возникают,

вначале репликационные глазки, а затем репликационные пузыри. Ре-

пликационный пузырь состоит из 2-х репликационных вилок.

291

Процесс репликации происходит в обеих репликационных вилках, но имеет противоположное направление. Противоположность направленности синтеза обусловлена тем, что цепи ДНК антипараллельны. Иными словами, нуклеотиды 5’-конца одной цепи комплементарно спарены с нуклеотидами 3’-конца другой цепи. А направление синтеза ДНК всегда одинаково – от 5’- к 3’-концу. В процессе распле-

ДНК-хеликаза на шарнире в противоположном направлении.

тения

ДНК перед ДНК-хеликазой возникает очень быстрое вращение ДНК. Это вращение способно в значительной степени затруднить репликацию и даже вызвать повреждения в структуре ДНК и ядре. Данное вращение устраняется ферментом ДНК-гиразой. Он обратимо разрывает одну цепь ДНК и обеспечивает ее вращение вокруг второй (целой) цепи как на шарнире. У эукариот ДНК-гираза не обнаружена. Вместо нее используются ферменты топоизомераза-I и топоизомераза-II. То- поизомераза-I подобна ДНК-гиразе. Топоизомераза-II способна осуществлять разрыв 2-х цепей ДНК, проводя в разрыв другую двойную спираль ДНК и затем восстанавливать целостность разорванных цепей. Таким образом, этот фермент препятствует спутыванию реплицирующейся молекулы ДНК.

Стадия инициации завершается синтезом короткого полирибонуклеотидного фрагмента (около 10 рибонуклеотидов) – праймера. Синтез осуществляется комплементарно материнской цепи ДНК фермен-

том праймаза.

292

1.3. Механизмы, обеспечивающие точность сборки дочерней цепи ДНК

Точность копирования ДНК очень высока. В среднем при копировании возникает 1 ошибка на 1 ×109 пар оснований (геном млекопитающих составляет 3×109 пар оснований). Точность сборки обеспечивается рядом механизмов, которые взаимно дополняют друг друга. Первым можно назвать способность ДНК-полимеразы-III проверять правильность встраивания нуклеотидов и, при необходимости, устранять возникшие нарушения.

ДНК-полимераза способна наращивать нуклеотидную последовательность, присоединяя нуклеотиды только к спаренному 3’-ОН- концу. Если происходит присоединение не комплементарного нуклеотида, то не образуется спаренный 3’-ОН-конец и, следовательно, ДНКполимераза не может присоединить очередной нуклеотид. Активируется 3’-5’-экзонуклеазная активность, что и приводит к удалению неправильно присоединенного нуклеотида и восстановлению способности ДНК-полимеразы удлинять цепочку ДНК.

При синтезе праймера предпочтение отдается рибонуклеотидам, а не дезоксирибонуклеотидам. Это также обеспечивает увеличение точности сборки ДНК. Для действия ДНК-полимеразы необходим спаренный 3’-ОН-конец. Для этого синтезируется затравка (праймер). Правильность встраивания нуклеотидов затравки не контролируется. Если бы затравка синтезировалась из дезоксирибонуклеотидов, то при возникновении ошибок спаривания – они не смогли бы быть обнаруженными. Поскольку затравка синтезируется из рибонуклеотидов – то ДНК-полимераза I опознает их как неправильные и замещает на дезоксирибонуклеотиды. Таким образом устраняется вероятность совершения ошибки при построении праймера.

1.4.Повреждения ДНК и ее репарация

Вживых системах ежеминутно происходит нарушение структуры молекулы ДНК. Наиболее часто встречаются следующие нарушения:

294

– апуринизация (каждая клетка человека теряет за сутки около 5000 пуриновых оснований вследствие термального разрыва N- гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой):

Дезаминирование

– Дезаминирование цитозина в урацил (до 100 нуклеотидов на 1

ло бы привести к выпадению нескольких пар оснований дочерней цепи ДНК после репликации или замене пары оснований. Например, каждое

дезаминирование Ц→У должно было бы вызвать замены пары Ц-Г на

295

Г-А. Такие замены, если бы они не восстанавливались, могли бы приводить к очень серьезным нарушениям в жизнедеятельности организма. Большая часть этих повреждений носит временный характер, поскольку они устраняются с помощью механизма, называемого репарацией ДНК. Если этот механизм не срабатывает, то изменения закрепляются. Подобные изменения называют мутацией. Восстановление структуры ДНК возможно только при условии сохранности комплементарного участка второй цепи ДНК.

Основной путь репарации включает 3 этапа:

1. Измененный участок ДНК распознается и удаляется при помощи ферментов ДНК-репарирующих нуклеаз. Каждый из этих ферментов распознает какой-либо 1 тип повреждения и устраняет его.

2.ДНК-полимераза связывается с 3’-концом поврежденной цепи ДНК и заполняет брешь, присоединяя нуклеотиды друг за другом комплементарно уцелевшей цепи.

3.ДНК-лигаза сшивает ДНК и, тем самым, завершает восстанов-

ление структуры ДНК.

Некоторые особенности структуры ДНК облегчают ее репарацию. В ДНК, в отличие от РНК, урацил заменен тимином. Репарационная система ДНК обладает механизмом способным распознавать и удалять продукты спонтанного дезаминирования цитозина – т.е. урацил. Если бы в состав ДНК входил урацил вместо тимина, то при распознавании таких нарушений вырезались бы и нормальные участки. Замена урацила на тимин позволяет избежать таких осложнений.

Важность репарации можно подчеркнуть следующим примером. У больных пигментной ксеродермой в клетках накапливаются пиримидиновые димеры. Это обусловлено нарушением процесса репарации, в котором участвуют как минимум 7 различных генных продуктов. Результатом такого нарушения является развитие тяжелого поражения кожи, включая рак.

296

Биосинтез РНК (транскрипция)

1. Структурно-функциональная организация транскриптона (оперона)

Участок ДНК, отвечающий за синтез белковой молекулы и я вляющийся единицей транскрипции, называют транскриптоном (у эукариот) или опероном (у прокариот). По функциональному признаку в опероне выделяют регуляторные и структурные области:

–Промотор – участок ДНК, к которому присоединяется РНКполимераза.

–Оператор – место связывания белка – репрессора. Белок-

репрессор кодируется геном-регулятором, который располагается вне оперона.

– Структурные гены – участки ДНК, несущие информацию о структуре белка. Структурные гены неоднородны и включают в себя интроны – не содержащие информации о структуре белка и экзоны – кодирующие структуру белковой молекулы.

– Терминатор – последовательность нуклеотидов, сигнализирующая о завершении транскрипции. Часто представлена рядом АТ-

последовательностей, которые у ряда прокариот распознаются ρ-

белком.

Такая структура оперона свойственна ДНК E.Coli. Он кодирует структуру фермента β-галактозидазы, разрушающего лактозу до глюкозы и галактозы. Поэтому он получил название Lac-оперона.

Структура транскриптона лишь в функциональном отношении совпадает со структурой оперона. Основные его компоненты могут отстоять друг от друга на значительном расстоянии. Например, у эукариот регуляторные белки связываются с участками ДНК, отстоящими от промотора на значительное расстояние. Выявлены участки, усиливающие транскрипцию – энхансеры (enhance – усиливать). Существуют последовательности, заставляющие молчать некоторые гены. Их называют сайленсерами (silence – заглушать).

297

Таким образом, структура транскриптона значительно более сложна, чем структура оперона.

2. Механизм транскрипции

Условно выделяют 3 стадии:

1.Инициации

2.Элонгации

3.Терминации

Процесс транскрипции осуществляется ферментом РНКполимеразой. У E.Coli РНК-полимераза состоит из 5 субъединиц: α2, β, β’, σ и ω. Считают, что β’-субъединица участвует в связывании с матрицей ДНК, β-субъединица осуществляет удлинение цепочки РНК, α2- субъединица принимает участие в выборе участка инициации транскрипции, σ-субъединица находит строго определенные последовательности нуклеотидов в промоторе.

На стадии инициации σ-субъединица находит соответствующий промотор, и происходит присоединение всей молекулы РНКполимеразы. После синтеза цепочки РНК примерно из 8 рибонуклеотидов σ-субъединица отделяется от ферментативного комплекса и мо-

жет быть использована другой РНК-полимеразой. Оставшийся без σ- субъединицы фермент называется кор-ферментом. У прокариот РНК-

полимеразы одного типа и лишь σ-субъединицы отличаются по строению в зависимости от того, какой промотор они находят.

На стадии элонгации кор-фермент осуществляет синтез РНК в направлении 5’→3’.

На стадии терминации белковый ρ-фактор опознает терминирующие последовательности ДНК и прекращает полимеразную реакцию. Кор-фермент отделяется от цепи ДНК и может повторно использоваться после присоединения σ-субъединицы.

У эукариот выделяют 4 класса РНК-полимераз (I, II, III и IV). РНК-полимераза-I синтезирует большие р-РНК, РНК-полимераза-II – и-РНК, РНК-полимераза-III- мяРНК и т-РНК. Однако, большая часть мяРНК синтезируется РНК-полимеразой-II. РНК-полимераза-IV транскрибирует геном митохондрий. Для опознавания промотора эукариотические РНК-полимеразы используют ряд белков, называемых фак-

торами транскрипции (ТF).

2.1.Созревание РНК (процессинг)

Врезультате транскрипции переписывается нуклеотидная последовательность оперона. Синтезированная молекула РНК является копией оперона и содержит информативные и неинформативные после-

298

довательности. Такая молекула РНК не может быть использована по назначению. Она называется предшественником РНК. Синтезируется 3 типа предшественников:

1)пре-иРНК (г-яРНК).

2)пре-Трнк.

3)пре-м-яРНК.

Информативные участки

Сшивание информативных участков

Модификация:

Процесс преобразования предшественников РНК называют процессингом. Процессинг включает в себя 3 операции:

1.Вырезание неинформативных участков.

2.Сшивание информативных участков – сплайсинг (to splice –

сращивать).

3. Модификация 5’ и 3’-концов РНК.

Вырезание неинформативных участков РНК осуществляется рибонуклеопротеиновыми комплексами, в состав которых входят мяРНК.

Процессинг

мяРНК на 5’ и 3’-концах имеют нуклеотидные последовательности комплементарные концевым последовательностям неинформативных участков. мяРНК служит матрицей, на которой неинформативный участок вытягивается в виде петли, при этом концы экзонов сближаются. Происходит вырезание неинформативных участков и сшивание информативных участков лигазой.

Модификация 5’ и 3’-концов осуществляется также в ядре клетки. К 5’-концу присоединяется олигонуклеотидная последовательность (2-3 метилированных нуклеотида), причем концевым является 7-

299

метилгуанозин. Эта последовательность носит название «кеп» (колпачок). К 3’-концу строго определенной нуклеотидной последовательности фермент поли-А-полимераза присоединяет полиадениловую последовательность. Считают, что такое модифицирование молекулы и-РНК предотвращает ее разрушение экзонуклеазами. Кроме того, «кеп» принимает участие в сборке рибосомы при синтезе белковой молекулы. После всех модификаций молекула РНК связывается с белком информофером с помощью поли-А-последовательности и переносится в цитозоль.

Процессинг пре-рРНК (45S) происходит в ядрышке. Вначале метилируется около 100 нуклеотидов, затем рибонуклеазы расщепляют 45S РНК на фрагменты 18S 5,8S и 28S р-РНК. Гены, кодирующие 5S р- РНК, находятся совершенно в другом месте, и 5SрРНК синтезируется отдельно от 45S р-РНК. Образовавшиеся 5,85, 28S и 5S РНК включаются в большую субъединицу рибосом. 18S р-РНК формируют малую субъединицу.

Пре-тРНК образуется в разных местах ДНК хромосом. В ходе процессинга могут образоваться 2 и более молекулы т-РНК. К т-РНК присоединяется 3’-концевая тринуклеотидная последовательность ЦЦА. Это акцепторный участок для присоединения соответствующей аминокислоты. Ряд оснований т-РНК специфически модифицируются (метилирование, дезаминирование, восстановление...). Они определяют вторичную структуру молекулы.

Обратная транскрипция

Впервые предсказана в 1962 году Говардом Теминым и открыта в 1970 году Девидом Балтимором. Процесс переноса генетической информации с РНК на ДНК возможен благодаря ферменту обратная транскриптаза (ревертаза). Это необычная форма ДНК-полимеразы, способная использовать в качестве матрицы и ДНК и РНК. Фермент обладает двумя типами активности.

1)Полимеразной – способен синтезировать цепь ДНК на матрице РНК или на матрице ДНК.

2)Нуклеазной – способен разрушать РНК. Структура молекулы закодирована на молекуле вирусной РНК. Такие вирусы называют ретровирусами. К ним относятся такие вирусы как вирус саркомы Ра уса,

вирус СПИДа и др. Геном ретровируса невелик – около 8500 нуклеотидов. В каждой вирусной частице содержится по 2 таких молекулы. Кроме РНК ретровирус содержит обратную транскриптазу.

300