2 курс / Биохимия / БИОХИМИЯ

трацию холестерина основных классов липопротеинов: ХС-ЛПВП, ХС- ЛПОНП и ХС-ЛПНП. На практике проводится определение общего хо-

лестерина, холестерина ЛПВП и триацилглицеринов, на основании полученных результатов рассчитывают ХС-ЛПОНП и ХС-ЛПНП (порядок

расчета изложен в работе "Расчет индекса атерогенности липидов"). Исходя из полученных результатов, определяют тип гиперлипопротеинемии.

Гиперхолестеринемия может быть первичной или семейной, обусловленной генетической предрасположенностью (например: из-за

отсутствия или недостатка рецепторов к ЛПНП) или преобладанием в рационе продуктов, богатых холестерином (животные жиры, яйца, твердые сыры и др.).

Но значительно чаще встречается вторичная гиперхолестеринемия, т.е. обусловленная различными заболеваниями. Наиболее часто гиперхолестеринемия наблюдается при: гипотиреозе, холестазе, ожирении, заболеваниях почек, сахарном диабете, приеме некоторых лекарственных препаратов (пероральные контрацептивы, гипотензивные препараты и др.),

Гипохолестеринемия – т.е. снижение концентрации менее 3,65 ммоль/л (у взрослых) имеет значительно меньшее клинико-

диагностическое значение, наблюдается при: голодании, злокачественных новообразованиях, гипертиреозе, тяжелых заболеваниях печени и т.д.

5. МЕТОД ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода состоит в том, что триацилглицерины гидролизуются липопротеинлипазой до глицерина и жирных кислот, глицерин через ряд реакций взаимодействует с глицеролкиназой, а затем с глицеринфосфатоксидазой с высвобождением перекиси водорода, которая в присутствии пероксидазы превращает 4-хлорфенол и 4-аминофеназон в

производное хиноноимидина, имеющего красную окраску, интенсивность которой пропорциональна концентрации триацилглицеринов.

Реактивы, исследуемый материал:

1. Рабочий реактив. 2. Стандартный раствор глицерина.

3. Исследуемая сыворотка.

Ход работы: В три пробирки (холостая, стандартная и исследуемая пробы) вносят по 1 мл рабочего реактива, затем в исследуемую пробу добавляют 0,01 мл сыворотки крови, в стандартную - 0,01 мл

стандартного раствора глицерина, инкубируют в течение 10 минут при 37 0С и колориметрируют при 500 нм против холостой пробы.

Процедура ручного пипетирования:

642

Концентрация триацилглицеринов рассчитывается по формуле:

Соп = (Еоп * Сст)/ Ест

где Соп – концентрация триацилглицеринов в исследуемой пробе, Еоп – оптическая плотность исследуемой пробы, Сст - концентрация триа-

цилглицеринов в стандартной пробе, Еоп – оптическая плотность стандартной пробы

Нормальный уровень триацилглицеринов в крови – 0,50 - 1,80 ммоль/л;

Диагностическое значение: В настоящее время установлено, что повышение концентрации триацилглицеринов (гипертриацилглицеринемия) является самостоятельным фактором риска развития атеросклероза и ИБС.

Европейское общество по борьбе с атеросклерозом и Международный комитет по оценке гипертриацилглицеринемии как сосудистого фактора риска (1996) разделяют уровень триацилглицеринов по степеням тяжести:

легкая гипертриацилглицеринемия - 1,81-2,25 ммоль/л; умеренная гипертриацилглицеринемия - 2,26-4,50 ммоль/л; высокая гипертриацилглицеринемия - > 4,50 ммоль/л.

Гипертриацилглицеринемия может быть первичной или семейной, обусловленной генетической предрасположенностью (например: из-за отсутствия или недостатка липопротеинлипазы) или преобладани-

ем в рационе некоторых продуктов (простые углеводы, алкоголь, животные жиры и др.).

Но значительно чаще встречается вторичная гипертриацилглицеринемия, т.е. обусловленная различными заболеваниями. Наиболее часто гипертриацилглицеринемия наблюдается при: сахарном диабете, ожирении, заболеваниях почек (нефротический синдром и хроническая почечная недостаточность), приеме некоторых лекарственных препаратов (пероральные контрацептивы, мочегонные, -блокаторы и др.),

Гипотриацилглицеринемия, т.е. снижение концентрации менее 0,5 ммоль/л (у взрослых), имеет значительно меньшее клинико-

диагностическое значение и наблюдается при: голодании, злокачественных новообразованиях, тяжелых заболеваниях печени и т.д.

643

6. РАСЧЕТ ИНДЕКСА АТЕРОГЕННОСТИ ЛИПИДОВ (ИА) НА ОСНОВАНИИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ОБЩЕГО

ХОЛЕСТЕРИНА, ХС-ЛПВП И ТРИАЦИЛГЛИЦЕРИНОВ

Индекс атерогенности (ИА) – это отношение холестерина атерогенных классов липопротеинов к холестерину антиатерогенных классов липопротеинов:

ИА= (ОХС – ХС-ЛПВП)/ХС-ЛПВП (абсолютных единиц).

Диагностическое значение: Установлено, что атерогенные гиперлипидемии являются одним из основных факторов риска развития атеросклероза. К настоящему времени во всем мире пришли к заключению, что для практической деятельности достаточно определения концентрации общего холестерина (ОХС), холестерина ЛПВП (ХС-ЛПВП),

триацилглицеринов (ТГ), определение липопротеина (а). Кроме того, рассчитывается индекс атерогенности (ИА) и уровень холестерина ЛПНП (ХС-ЛПНП).

Индекс атерогенности используется для оценки степени риска развития атеросклероза, ИБС.

Норма – до 3

низкий риск – 3-4 средний риск – 4-5

высокий риск – более 5.

Для определения тактики ведения пациента необходимо рассчитать ХС-ЛПНП:

ХС-ЛПНП = ХСобщ – ХС-ЛПВП – ХС-ЛПОНП ХС-ЛПОНП = ТГ *0,458

По классификации Европейского общества по борьбе с атеросклерозом уровень ХС-ЛПНП разделяется по степеням тяжести:

нормальный уровень ХС-ЛПНП - 1,91-2,60 ммоль/л; легкое увеличение уровня ХС-ЛПНП - 2,61-3,40 ммоль/л;

умеренное увеличение уровня ХС-ЛПНП - 3,41-5,05 ммоль/л; выраженное увеличение уровня ХС-ЛПНП - > 5,05 ммоль/л.

Диагностическое значение определения уровня ХС-ЛПНП:

1.По уровню увеличения ХС-ЛПНП проводится общая стратификация

ведения пациентов: т.е. определяют, подходят ли пациенту диетические мероприятия или нужна сразу медикаментозная терапия.

2.Уровень увеличения ХС-ЛПНП оказывает влияние на жесткость и

длительность диетических мероприятий

3.При проведении гиполипидемической терапии целевыми уровнями являются ХС-ЛПНП и общий холестерин.

644

7.МЕТОД ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЧЕВИНЫ

ВСЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода: Уреаза гидролизует мочевину с образованием аммиака и углекислого газа. Выделенный аммиак с хромогеном и гипохлоритом натрия образует окрашенный продукт химической реакции, интенсивность окраски которого определяют фотометрически.

Реактивы, исследуемый материал:

1.Реактив №1 (ферментный реагент), реактив №2 (хромоген), реактив №3 (натрия гипохлорит).

2.Стандартный раствор мочевины.

3.Исследуемая сыворотка.

Ход работы: В опытной пробирке смешивают 0,01 мл сыворотки с 0,25 мл рабочего раствора №1, в контрольной пробирке - 0,01 мл стандартного раствора мочевины и 0,25 мл рабочего раствора №1 ин-

кубируют в течение 10 минут при 37 0С Процедура ручного пипетирования:

После инкубации во все пробы последовательно добавляют по 0,5 мл реактива №2, затем реактива №3, инкубируют 5 минут при 37 0С и

колориметрируют при 590 нм против холостой пробы. Концентрация мочевины рассчитывается по формуле:

Соп = (Еоп * Сст)/ Ест где Соп – концентрация мочевины в исследуемой пробе, Еоп – оптиче-

ская плотность исследуемой пробы, Сст - концентрация мочевины в

стандартной пробе, Еоп – оптическая плотность стандартной пробы

Нормальное содержание мочевины:

в сыворотке крови 2,5-8,3 ммоль/л, в моче – 333,0-587,7 ммоль/л.

Диагностическое значение: Мочевина синтезируется в печени, это продукт общего обезвреживания аммиака. Ее выделение с мочой – главный путь экскреции азота.

Повышение уровня мочевины в сыворотке крови наблюдается чаще всего при заболеваниях почек: при почечной недостаточности, нефритах, рефлекторной анурии, почечно-каменной болезни и др.

Однако увеличение концентрации мочевины может быть обусловлено целым рядом причин, не связанных с заболеваниями почек:

1. Увеличение образования мочевины:

645

потребление большого количества белка,

усиление катаболизма белка.

2. Усиление реабсорбции:

при значительном обезвоживании.

Следует отметить такие заболевания, как болезнь Аддисона, тяжелые инфекционные заболевания, сопровождающиеся интенсивным распадом белков, ожоги, перитониты.

Уменьшение содержания мочевины в крови наблюдается при нарушении мочевинообразовательной функции печени в результате паренхиматозной желтухи, острой дистрофии органа, декомпенсированного цирроза.

8. БЕНЗИДИНОВАЯ ПРОБА НА КРОВЬ

Принцип реакции: Гемоглобин расщепляет перекись водорода с высвобождением атомарного кислорода, который окисляет бензидин. Образующиеся продукты окисления бензидина имеют синюю или зеленую окраску.

Реактивы, исследуемый материал:

1.Дефибринированная кровь, разведенная водой.

2.Раствор бензидина, 50 г/л (в ледяной уксусной кислоте, свежеприготовленный).

3.Раствор перекиси водорода, 30 г/л.

Ход работы: В одну пробирку налить 5 капель разведенной дефибринированной крови и 5 капель бензидина, затем добавить 5 капель раствора перекиси водорода. В другую пробирку прилить 5 капель дистиллированной воды, 5 капель бензидина и 5 капель перекиси водорода. Сравнить полученные результаты.

Диагностическое значение: Реакция очень чувствительна и используется для обнаружения даже небольших количеств крови. В клинической практике эта реакция положена в основу обнаружения скрытой крови в кале, а также для контроля предстерилизационной очистки инструментария и посуды.

9. КАЧЕСТВЕННАЯРЕАКЦИЯНАСАХАРВМОЧЕ

Принцип реакции: Для качественного обнаружения сахара в мо-

че используют реактив Ниландера, содержащий азотнокислый висмут. В щелочной среде образуется гидрат окиси висмута, который восстанаваливается глюкозой до металлического висмута, окрашивающего жидкость в черно-бурый цвет.

Реакция Ниландера специфично используется для обнаружения сахара в моче, т.к. азотнокислый висмут не восстанавливается мочевой

646

кислотой (нормальный компонент мочи) в отличие от гидрата окиси меди (реакция Троммера и с жидкостью Фелинга).

Реактивы, исследуемый материал:

1.Моча, содержащая глюкозу, и нормальная моча

2.Реактив Ниландера.

Ход работы: К 20 каплям исследуемой мочи прилить 20 капель реактива Ниландера и кипятить 1-2 минуты.

Диагностическое значение: Моча здорового человека содержит минимальное количество глюкозы, которое обычными методами не определяется, поэтому принято считать, что в норме глюкозы в моче нет. Обнаружение глюкозы в моче называется глюкозурия. При превышении почечного порога (это 7,8-9,99 ммоль/л глюкозы в крови) глюкоза появляется в моче.

Почечный порог выделения – это концентрация вещества в крови, превышение которой ведет к прекращению его реабсорбции в почечных канальцах.

Почечный порог глюкозы может увеличиваться – при атеросклеротическом поражении сосудов почек, а также уменьшаться – при так называемом почечном диабете (эссенциальная почечная глюкозурия – аутосомно-рецессивное заболевание), когда глюкозурия появляется при

нормальной концентрации глюкозы в крови. Глюкозурия может быть:

физиологическая – при стрессах, повышенном приеме углеводов пожилыми людьми,

экстраренальная – т.е. не связанная с заболеваниями почек. Она встречается при сахарном диабете, панкреатитах, феохромоцитомах, гипертиреозе, инсультах, отравлениях окисью углерода, морфием, хлороформом и т.д.,

ренальная – почечный диабет, хронические нефриты, острая почечная недостаточность, гестозы беременных, отравления фосфором.

10.КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ФЕНИЛПИРОВИНОГРАДНУЮ КИСЛОТУ (ПРОБА ФЕЛИНГА)

Принцип пробы Фелинга: Фенилпировиноградная кислота с ионами трехвалентного железа образует комплексное соединение сине-

зеленого цвета.

Реактивы, исследуемый материал:

1. Раствор хлорного железа, 100 г/л. 2. Моча. 3. Фильтровальная бумага. Ход работы На фильтровальную бумагу нанести несколько ка-

пель мочи, добавить 8-10 капель раствора хлорного железа. Оценить ре-

зультат.

647

Диагностическое значение: В норме основным путем превращения фенилаланина в тканях (в основном в печени) является его окисление фенилаланингидроксилазой в тирозин. Вследствие дефекта гена, ответственного за выработку в печени этого фермента, не происходит его синтеза. Фенилаланин начинает превращаться по компенсаторному пути

– вступает в переаминирование с образованием фенилпировиноградной кислоты. Фенилпируват накапливается в крови, тканях, выводится с мочой; развивается фенилкетонурия. Вследствие накопления фенилпирувата нарушается синтез миелина и миелинизация нервных волокон, а вследствие недостатка тирозина отмечается дефицит Т3, Т4, дофамина и

катехоламинов, в результате дети отстают в умственном развитии, развивается фенилпировиноградная олигофрения. Своевременное выявление этой ферментопатии позволяет изменить характер питания (ограничение поступления фенилаланина, в том числе и с молоком матери) и предупредить развитие олигофрении.

Проба Фелинга до недавнего времени была обязательным элементом скрининга. Однако, для того, чтобы фенилпируват в моче присутствовал в обнаруживаемых этим методом количествах, необходимо длительное время (не ранее 2-х месячного возраста ребенка), к этому вре-

мени уже развивается уже стадия выраженного заболевания, а терапевтические мероприятия необходимо проводить с первых жизни. К 2 месяцам жизни у ребенка с фенилкетонурией уже имеется развернутая клиническая картина заболевания. Особенно это заметно у смуглокожих и темноволосых детей: наступает гипопигментация кожи, начинают заметно светлеть волосы и глаза. К 4-х месячному возрасту уже видны

проявления энцефалопатии: у ребенка исчезает "комплекс оживления", возникающий в норме на обращение к нему взрослого.

В настоящее время для ранней диагностики фенилкетонурии проводят пробу Гатри. Она заключается в том, что диск с кровью, новорожденного, помещают на питательную среду с бактериями, нуждающимися для роста в фенилаланине. При наличии этой аминокислоты в крови при фенилкетонурии идет рост этих микроорганизмов.

11.КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА КЕТОНОВЫЕ ТЕЛА В МОЧЕ

Принцип реакции: Ацетон и ацетоуксусная кислота в щелочной среде образуют с нитропруссидом натрия оранжево-красное окрашива-

ние (проба Легаля). После подкисления концентрированной уксусной кислотой образуется соединение вишневого цвета.

Реактивы, исследуемый материал:

1.Моча.

2.Раствор нитропруссида натрия, 100 г/л.

3.Концентрированная уксусная кислота.

648

4. Раствор едкого натра, 100 г/л.

Ход работы: В пробирку налить 1 каплю мочи, 1 каплю раствора едкого натра и 1 каплю свежеприготовленного нитропруссида натрия. Наблюдать появление оранжево-красного окрашивания. Добавить 3 кап-

ли концентрированной уксусной кислоты. Оценить результат.

Диагностическое значение: Нормальная моча содержит незначительные количества кетоновых тел (20-50 мг в сутки), которые не об-

наруживаются обычными качественными пробами. Наличие кетоновых тел в моче называется кетонурия. Кетоновые тела – это продукты неполного окисления липидов и белков: -гидрооксимасляная кислота,

ацетоуксусная кислота и ацетон. Кетоновые тела синтезируются в печени. Их определение имеет наибольшее значение для диагностики метаболической декомпенсации сахарного диабета. Обычно кетонурия появляется при уровне глюкозы в крови 13,5-16,7 ммоль/л и/или при глю-

козурии более 3 %. Кетонурия может определяться при:

некомпенсированном диабете,

гиперкетонемической коме,

несбалансированном питании (голодание, диета, направленная на похудание, употребление преимущественно белковой пищи, исключение из рациона углеводов),

гиперпродукция кортикостероидов (опухоли гипофиза или надпочечников),

дизентерия, токсикозы в детском возрасте, приводящие к кетоацидозу.

12.ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ГЛЮКОЗЫ, КЕТОНОВЫХ ТЕЛ, БЕЛКА

ИПРИМЕСЕЙ КРОВИ В МОЧЕ МЕТОДОМ "СУХОЙ" ХИМИИ ПРИ ПОМОЩИ ТЕСТ-ПОЛОСОК ФИРМЫBOEHRINGER МАNNНЕIМ

Принцип метода: Тест-полоска представляет собой полифункциональную диагностическую тест-систему, с помощью которой прово-

дится не только качественное, но и полуколичественное определение показателей, позволяющих оценить физико-химические свойства мочи.

На полоске имеется несколько зон индикации (количество зависит от марки тест-полоски, фирма BOEHRINGER МАNNНЕIМ производит око-

ло 50 наименований). Зоны пропитаны различными веществами, которые взаимодействуют с метаболитами мочи, при этом развивается цветное окрашивание зоны индикации, интенсивность которого пропорциональна концентрации исследуемых веществ. На упаковке имеется шкала индикации, с которой сравнивают исследуемую тест-полоску.

649

Ход работы: В пробирку налить примерно около 10-15 мл мочи. Окунуть в нее на несколько минут тест-полоску. После развития окраски сравнить со шкалой нанесенной на коробке тест-полосок.

Диагностическое значение: Глюкоза - при патологии имеет ме-

сто глюкозурия, которая обусловлена:

–повышением содержания глюкозы в крови выше пороговых величин (7,8-9,9 ммоль/л); может наблюдаться при сахарном диабете, стероидном

диабете и ряде других процессов;

–при дефекте белка-переносчика, участвующего в реабсорбции глюкозы в проксимальных канальцах (почечный диабет).

Кетоновые тела - выделение определяемых количеств называется

кетонурией. При сахарном диабете ежесуточно может выделяться до 150 г кетоновых тел. С мочой всегда выделяются вместе ацетон и ацетоуксусная кислота; -гидроксимасляная кислота появляется в моче лишь

при сильном увеличении экскреции кетоновых тел. Кетонурия бывает при диабете, голодании, тиреотоксикозе (усиленный распад углеводов), при инфекционных заболеваниях.

Белок - повышение белка в моче - протеинурия. Источники белка

мочи — белки плазмы крови и белки почечной ткани (при патологии). Протеинурии делятся на почечные и внепочечные. При почечных протеинуриях белки плазмы крови попадают в мочу из-за органического

повреждения нефрона, увеличения размеров пор почечного фильтра и замедления тока крови в клубочках. Внепочечные протеинурии связаны с поражением мочевых путей или предстательной железы. В моче возможно определение белков-ферментов, например, при панкреатитах находят повышение активности α-амилазы, трипсина.

Кровь в моче — гематурия. Аналогично протеинурии может быть почечная и внепочечная. Почечная обусловлена патологией почек. Внепочечная - патологией мочевыделительных путей.

13.РАСЧЕТ СУТОЧНОЙ ДОЗЫ ИНСУЛИНА ДЛЯ БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ

До недавнего времени суточную дозу инсулина рассчитывали исходя из суточной глюкозурии или по содержанию глюкозы в крови. Однако в настоящее время, доза инсулина подбирается в зависимости от веса больного с учетом длительности заболевания.

Принцип метода: Для поддержания гомеостаза человеку необходимо в среднем 20-40 ЕД инсулина в сутки. Расчет суточной дозы инсу-

лина (СДИ) больным производится исходя из расчета на фактическую массу тела больного с учетом длительности заболевания. Ориентировочно это соответствует:

0,3 Ã 0,5 ЕД/кг/сутки Ã при стаже диабета менее 10 лет.

650

0,7 Ã 0,9 ЕД/кг/сутки Ã при стаже диабета более 10 лет.

Доза вводимого препарата подбирается и корригируется с учетом уровня гликемии. Нормальные колебания гликемии в течение суток от 4,0 до 9,5 ммоль/л.

В прекоматозном и коматозном состоянии, независимо от стажа заболевания, доза инсулина может увеличиваться от 0,9 – до 1,0 ЕД/кг/сутки.

Суточная доза распределяется на 3 инъекции в соотношении 3:2:1 или 50%, 35%, 15%. Например, 40 ед. инсулина распределяются: 20 ед. перед завтраком. 14 - перед обедом и только 6 ед. перед ужином.

Клинический пример:

1. Больной 29 лет, болен сахарным диабетом в течение 12 лет, вес

больного 72 кг.

0,8*72 = 57,6 ЕД/сутки. Эта доза разделяется на 3 приема: 28,8 ЕД – перед завтраком, 19,2 ЕД – перед обедом, 9,6 ЕД – перед ужином.

2. Больной 16 лет, болен сахарным диабетом 2 года, вес 30 кг.

0,3*30 = 9 ЕД/сутки. Эта доза разделяется на 3 приема: 4,5 ЕД – перед завтраком, 3,0 ЕД – перед обедом, 1,5 ЕД – перед ужином.

14. КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В МОЧЕ (ПРОБА ГЕЛЛЕРА)

Принцип метода: Концентрированная азотная кислота вызывает денатурацию белка. Выпадение белка в виде осадка (или мутного кольца) связано с денатурацией белковых частиц и образованием комплексных солей белка с кислотами.

Реактивы, исследуемый материал:

1. Моча, содержащая белок, и нормальная моча.

2. Концентрированная азотная кислота с хлористым натрием.

Ход работы: При проведении пробы Геллера с концентрированной азотной кислотой надо работать осторожно. В пробирку налить с помощью капельницы приблизительно около 1 мл (20 капель) концентрированной азотной кислоты. Затем осторожно наслоить примерно равный объем профильтрованной мочи из пипетки по стенке пробирки так, чтобы жидкость не смешивалась! Оценить результат.

Диагностическое значение: В моче здорового человека содержится 0,005-0,008 г/л белка, это количество не определяется применяе-

мыми методами исследования. В норме могут определяться следы белка

– 0,025-0,1 г/л. Наличие белка в моче называется протеинурия. Потеря

белка свыше 3 г/л считается массивной.

Протеинурия бывает функциональной (или физиологической), при этом содержание белка в моче, как правило, не превышает 0,3 г/л и патологической, т.е. возникающей при различных заболеваниях.

651