2 курс / Биохимия / БИОХИМИЯ

общий билирубин 50 мкмоль/л, прямой билирубин 5,1 мкмоль/л. Анализ мочи: билирубин (–), уробилиноген (+++). Анализ кала: стеркобилиноген выше нормы. Ваше заключение.

Ответ: Гемолитическая желтуха.

3.Результаты обследования больного анализ крови: общий билирубин 30 мкмоль/л, прямой билирубин 20 мкмоль/л. Анализ мочи: билирубин (+), уробилиноген (–). Анализ кала: стеркобилиноген резко снижен. Ваше заключение.

Ответ: Обтурационная желтуха.

4.Некоторые мутации гена гемоглобина оказывают влияние на

синтез всех трех типов гемоглобина – А1, А2 и F, тогда как другие –

только на один из них. Почему?

Ответ: Мутации гена -цепей влияют на все три вида гемогло-

бина, поскольку эти гемоглобины имеют соответственно следующее субъединичное строение 2 2 2 2 2 2. Мутации генов -, - и -

цепей скажутся только на одном из типов гемоглобина.

5. При изучении транспорта кислорода у беременных было пока-

зано, что кривые насыщения гемоглобина в крови матери и плода, полученные в одних и тех же условиях, сильно различаются.

а) Какой гемоглобин обладает при физиологических условиях более высоким сродством к кислороду? Какое физиологическое значение имеет тот факт, что два гемоглобина обладают разным сродством к кислороду?

Ответ: а) Hb F, то есть гемоглобин плода. б) Hb F забирает О2 от

Hb А матери.

6. Единичная молекула ДНК в хромосоме E.coli (м.м.

2800000000) содержит около 4,5 млн. мононуклеотидов. Высота каждой нуклеотидной единицы вам известна. Вычислите общую длину молекулы ДНК и сравните с длиной клетки E.coli – 2 мкм.

Ответ: 0,34 нм, 1530 мкм, в 750 раз больше.

632

7. Будет ли отличаться подвижность гемоглобина S от нормального гемоглобина А при электрофорезе в веронал-мединаловом

буфере (рН=8,6)?

Ответ: Скорость движения гемоглобина S уменьшится в связи с тем, что в -цепях остатки глу в 6-ом положении замещены на вал.

8.При рН 8,0 был проведен электрофорез смеси липидов, содержащей а) фосфатидилэтаноламин, б) фосфатидилолин, в) фосфатидилсерин. Укажите, какие из этих соединений должны двигаться к катоду (К), аноду (А) или оставаться на старте и почему?

Ответ: а) А, б) старт, в) А.

9.Лекарственный препарат аспирин представляет собой слабую кислоту с рК’=3,5. Всасывание его в кровь может происходить через слизистую желудка и тонкого кишечника. Где аспирин легче всасывается – в желудке или в тонком кишечнике, если величина рН желудочного сока близка к 1, а рН в тонком кишечнике – к 6.

Ответ: В желудке. Через клеточную мембрану быстро проходят незаряженные гидрофобные молекулы, а ионизированные и полярные

–медленно. Соляная кислота подавляет диссоциацию аспирина, и поэтому в неионизированном виде он будет всасываться.

10.Гистидин – положительно заряженная аминокислота имеет три ионизированные группы. Напишите, как будет ионизироваться гистидин при рН: 1. 2,3; 2. 6,0; 3. 9,0; 4. 12,0. К какому электроду он будет двигаться в электрическом поле при этих значениях рН?

Ответ:

11. При обработке инсулина надмуравьиной кислотой были разрушены дисульфидные связи и разделены А- и В-цепи. Представлена аминокислотная последовательность В-цепи: Фен-Вал-Асн-Глн-Гис- Лей-Цис-SO3H-Гли-Сер-Гис-Лей-Вал-Глу-Ала-Лей-Тир-Лей-Вал-Цис- SO3H-Гли-Глу-Арг-Гли-Фен-Фен-Тир-Тре-Про-Лиз-Ала. Укажите, в

каких местах произойдет ее расщепление под действием а) трипсина,

633

б) химотрипсина.

Ответ: Фен Вал-Асн-Глн-Гис-Лей-Цис-SO3H-Гли-Сер-Гис- Лей-Вал-Глу-Ала-Лей-Тир Лей-Вал-Цис-SO3H-Гли-Глу-Арг(Т)Гли- Фен Фен Тир Тре-Про-Лиз(Т)Ала

12. В лаборатории два студента независимо друг от друга выде-

лили фермент лактатдегидрогеназу (из сердца цыпленка), восстанавливающую пируват в лактат. Фермент был получен в виде концентрированного раствора. Затем оба студента измерили ферментативную активность полученных ими растворов и определена Vmах, Кm и

удельная активность. При сравнении результатов оказалось, что значения Кm у них совпадали, а удельная активность у одного была равна

100, а у другого – 150. Чем отличались выделенные ферменты? Ответ: Степенью очистки. У первого студента фермент был ху-

же очищен от белков, вследствие чего оказалась ниже удельная активность.

634

ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ

1.МЕТОД ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ

ВСЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип: глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием перекиси водорода, при разрушении которой под влиянием пероксидазы происходит конденсация фенола и р-аминоантипирина в окрашенное соединение. Интенсив-

ность окрашивания при этом пропорциональна концентрации глюкозы.

Реактивы, исследуемый материал:

1. Рабочий реактив. 2. Стандартный раствор глюкозы.

3. Исследуемая сыворотка.

Ход работы: В три пробирки (холостая, стандартная и исследуемая пробы) вносят по 1 мл рабочего реактива, затем в исследуемую пробу добавляют 0,01 мл сыворотки крови, в стандартную - 0,01 мл стандартного раствора глюкозы, инкубируют в течение 15 минут при 37 0С и колориметрируют при длине волны 500 нм против холостой пробы.

Процедура ручного пипетирования:

Концентрация глюкозы рассчитывается по формуле:

Соп = (Еоп * Сст)/ Ест

где Соп – концентрация глюкозы в исследуемой пробе, Еоп – оптическая плотность исследуемой пробы, Сст - концентрация глюкозы в стандарт-

ной пробе, Еоп – оптическая плотность стандартной пробы

Нормальная концентрация глюкозы крови – 3,65-6,11 ммоль/л.

Диагностическое значение:

Повышение глюкозы в крови выше 6,11 ммоль/л называется гипер- гликемией. Различают две основных группы гипергликемий:

1.Инсулярные – связанные с недостаточным содержанием в организме инсулина или обусловленные неэффективностью его действия (сахарном диабете, панкреонекрозе)

2.Экстраинсулярные – не зависящие от влияния инсулина:

повышенная гормональная функция щитовидной железы (гипертиреоз), надпочечников (феохромоцитома), гипофиза,

диффузные поражения печени,

механическое и токсическое поражение ЦНС,

635

травмы и опухоли мозга,

эпилепсия,

сильный эмоциональный стресс,

отравления окисью углерода, стрихнином и др. веществами. Наиболее существенное значение в формировании экстраинсулярных гипергликемий имеют следующие механизмы:

усиленный распад гликогена,

повышенный глюконеогенез,

торможение синтеза гликогена,

снижение утилизации глюкозы под влиянием гормонов – антагонистов инсулина.

Гипогликемия

Считается, что это состояние имеет место, когда уровень глюкозы в цельной крови менее 2,2 ммоль/л, а при определении ферментативным методом в сыворотке крови – менее 2,5 ммоль/л.

Симптомы гипогликемии могут быть обусловлены избыточной секрецией адреналина (слабость, потливость, тремор, тахикардия, чувство страха и голода) и дисфункцией ЦНС (головная боль, утрата двигательных функций, спутанность сознания, аномальное поведение, нарушение или потеря сознания).

Гипогликемия опасна тем, что глюкоза является жизненно важным энергетическим сырьем для головного мозга.

Причины гипогликемии по механизму развития можно разделить на три группы:

1.Сниженный выход глюкозы

2.Увеличение утилизации глюкозы

3.Сниженный выход и увеличение утилизации глюкозы На практике гипогликемия чаще всего наблюдается при:

передозировке инсулина или других сахароснижающих препара-

тов,

гипотиреозе, надпочечниковой недостаточности,

гиперфункции островков Лангерганса поджелудочной железы (аденомы, гиперплазии, гипертрофии),

алиментарная гипогликемия (голодание, длительные перерывы между приемами пищи).

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Принцип метода: в основе количественного метода лежит биуретовая реакция: в щелочной среде ионы меди образуют с белками комплексные соединения фиолетового цвета. Интенсивность окраски рас-

636

твора пропорциональна концентрации белка, которую измеряют фотометрически.

Реактивы, исследуемый материал:

1.Биуретовый реактив (рабочий реактив).

2.Стандартный раствор белка.

3.Сыворотка крови.

Ход работы: В три пробирки (холостая, стандартная и исследуемая пробы) вносят по 1 мл рабочего реактива, затем в исследуемую пробу добавляют 0,02 мл сыворотки крови, в стандартную - 0,02 мл

стандартного раствора белка. Через 30 минут колориметрировать при длине волны 546 ±10 нм против холостой пробы.

Процедура ручного пипетирования:

Концентрация общего белка рассчитывается по формуле:

Соп = (Еоп * Сст)/ Ест

где Соп – концентрация общего белка в исследуемой пробе, Еоп – оптическая плотность исследуемой пробы, Сст - концентрация общего белка

в стандартной пробе, Еоп – оптическая плотность стандартной пробы

Нормальная концентрация общего белка крови у взрослых – 65-85 г/л, у детей – 56-85 г/л

Диагностическое значение: Плазма крови человека содержит в норме более 100 видов белков. Около 90 % общего белка составляют альбумин, иммуноглобулины, липопротеины, фибриноген, трансферрин. Другие белки присутствуют в плазме в значительно меньших количествах.

Понижение концентрации общего белка в крови называется гипопро-

теинемией, соответственно повышение – гиперпротеинемией.

Причинами гипопротеинемии являются:

алиментарный фактор (т.е. недостаточное поступление белка с пищей): голодание, недоедание, связанные как со всевозможными диетами, так и такими заболеваниями, как стеноз пищевода, стеноз пилорического отдела желудка,

неусваивание белка вследствие различных заболеваний желудочно- кишечного тракта, например: хронические энтериты,

нарушение биосинтеза белка: гепатиты, циррозы, выраженные интоксикации, врожденные нарушения синтеза отдельных белков – анальбуминемия, болезнь Вильсона-Коновалова,

637

потеря белка с кровью (острые и хронические кровотечения) и мочой (нефротический синдром),

перемещение белка в другие ткани – это образование отеков, переход

втак называемое третье пространство (выпоты в серозные полости,

впросвет кишечника, на ожоговую поверхность),

повышение распада белка в организме: опухоли, повышенная функция щитовидной железы, всегда имеет место при кишечной непроходимости,

физиологическое снижение концентрации белка, например, в по-

следние месяцы беременности и в период лактации.

Относительное снижение концентрации общего белка может наблюдаться при увеличении объема циркулирующей жидкости: большое введение жидкостей внутривенно-капельно, прекращении или резком

уменьшении диуреза; гиперпродукции антидиуретического гормона гипоталамуса, сердечной декомпенсации.

Гиперпротеинемия встречается редко. Абсолютная гиперпротеинемия (т.е. не связанная с нарушением водного баланса) наблюдается при миеломной болезни, хронических полиартритах, длительно протекающих воспалительных процессах. Относительная (т.е. вызванная снижением объема циркулирующей жидкости) - при тяжелых ожогах, пери-

тоните, неукротимой рвоте и поносе, несахарном диабете, непроходимости кишечника, хронической почечной недостаточности, усиленном потоотделении.

Следует помнить, что при некоторых заболеваниях, в частности кишечной непроходимости, разлитом перитоните возникающая относительная гиперпротеинемия, обнаруживаемая в биохимическом анализе крови, маскирует характерный для этой патологии дефицит белка.

Гипопротеинемия почти всегда связана с гипоальбуминемией, а гиперпротеинемия – почти всегда с гиперглобулинемией.

3. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЬБУМИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ С БРОМКРЕЗОЛОВЫМ ЗЕЛЕНЫМ

Принцип метода состоит в том, что альбумин с бромкрезоловым зеленым в слабо кислой среде образует окрашенный комплекс синего цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации альбумина.

Реактивы, исследуемый материал:

1.Раствор бромкрезолового зеленого (рабочий реактив).

2.Стандартный раствор альбумина.

3.Исследуемая сыворотка.

638

Ход работы: В три пробирки (холостая, стандартная и исследуемая пробы) вносят по 1 мл рабочего реактива (бромкрезолового зеленого), затем в исследуемую пробу добавляют 0,01 мл сыворотки крови, в стандартную - 0,01 мл стандартного раствора альбумина, инкубируют в течение 10 минут при 37 0С и колориметрируют при 630-690 нм против

холостой пробы.

Процедура ручного пипетирования:

Концентрация альбумина рассчитывается по формуле:

Соп = (Еоп * Сст)/ Ест

где Соп – концентрация альбумина в исследуемой пробе, Еоп – оптическая плотность исследуемой пробы, Сст - концентрация альбумина в

стандартной пробе, Еоп – оптическая плотность стандартной пробы

Нормальная концентрация альбумина крови – 35-52 г /л.

Определение концентрации альбумина в крови имеет очень важное диагностическое значение. Это обусловлено тем, что:

1.альбумин является показателем, характеризующим тяжесть тех заболеваний, которые сопровождаются гипоальбуминемией;

2.альбумин является основным транспортным белком в организме.

Сальбумином транспортируются: половина всего кальция, свободные жирные кислоты, билирубин, гормоны, лекарственные препараты.

Диагностическое значение: Большее диагностическое значение имеет обнаружение гипоальбуминемии. Клинически проявляется:

слабостью,

отеками нижних конечностей. При содержании альбумина в сыворотке крови ниже 30 г/л онкотическое давление снижается настолько, что вода из сосудистого русла переходит во внесосудистое – образуются отеки на нижних конечностях, скапливается жидкость в серозных полостях (брюшной – асцит, плевральной – плеврит, перикардиальной – перикардит).

судорогами, вследствие гипокальциемии. Комплекс альбумин-кальций

является транспортной формой кальция. И возникает ситуация, когда при определении в крови нормальной концентрации кальция, на самом деле из-за гипоальбуминемии отмечается скрытый дефицит кальция.

Причины гипоальбуминемии:

1)снижение поступления и синтеза вследствие: недостаточного питания, дефектов пищеварения, нарушения абсорбции, заболеваниях печени. Печень является местом синтеза альбумина, поэтому снижение

639

его концентрации может служить тестом для оценки ее функционального состояния, например: гипоальбуминемия при хроническом гепатите и циррозе имеет неблагоприятное прогностическое значение.

2)увеличение потери альбумина при кровотечениях, анафилактическом шоке, альбуминурии (т.е. выделении с мочой), при образовании выпотов в серозные полости, при хронических поносах, при хронических заболеваниях почек (например, при нефротическом синдроме, когда концентрация альбумина в крови может достигать 5 г/л при уровне общего белка 25-30 г/л). В хирургической практике это имеет место при

так называемых болезнях оперированного желудка (после гастрэктомии или резекции 2/3 желудка), при кишечной непроходимости, остром панкреатите, холецистите, острых флегмонах, абсцессах легких. Выраженная гипоальбуминемия или ее усугубление в динамике при тяжело протекающих хирургических заболеваниях расценивается как крайне неблагоприятный прогностический фактор. Это объясняется двумя причинами:

-Уровень альбумина служит показателем эндогенной интоксикации,

ичем выраженнее интоксикация, тем ниже уровень альбумина,

-Гипоальбуминемия приводит к снижению биологической доступности и длительности нахождения в кровеносном русле используемых фармацевтических препаратов, в частности антибиотиков, гормонов, сульфаниламидов и некоторых других.

3)усиление катаболизма альбуминов наблюдается у больных гипертиреозом, гиперкортизолемией, длительной лихорадкой, обширными травмами.

Чаще всего изменения содержания альбумина в плазме бывают вторичными, т.е. причиной являются какие-либо заболевания. Первич-

ные нарушения очень редки и представляют собой наследственные заболевания. К ним относится анальбуминемия (т.е. отсутствие альбумина) и двойная альбуминемия (бисальбуминемия) – протекает бессимптомно, при электрофорезе белков сыворотки крови выявляют две фракции альбуминов.

Гиперальбуминемия. Абсолютная гиперальбуминемия практически не встречается. Относительная связана с гипо- или дегидратацией, т.е. со

снижением объема циркулирующей жидкости.

4. МЕТОД ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода состоит в том, что холестерин окисляется холестеролоксидазой с высвобождением перекиси водорода, которая в присутствии пероксидазы превращает р-аминоантипирин в окрашенное со-

640

единение, интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина.

Реактивы, исследуемый материал:

1. Рабочий реактив. 2. Стандартный раствор холестерина.

3. Исследуемая сыворотка.

Ход работы: В три пробирки (холостая, стандартная и исследуемая пробы) вносят по 1 мл рабочего реактива, затем в исследуемую пробу добавляют 0,01 мл сыворотки крови, в стандартную - 0,01 мл

стандартного раствора холестерина, инкубируют в течение 10 минут при 37 0С и колориметрируют при 500 нм против холостой пробы.

Процедура ручного пипетирования:

Концентрация холестерина рассчитывается по формуле:

Соп = (Еоп * Сст)/ Ест

где Соп – концентрация холестерина в исследуемой пробе, Еоп – оптическая плотность исследуемой пробы, Сст - концентрация холестерина в

стандартной пробе, Еоп – оптическая плотность стандартной пробы

Нормальный уровень общего холестерина - 140- 200 мг/дл или 3,65-5,2 ммоль/л,

При рождении концентрация общего холестерина менее 2,6 ммоль/л, затем она постепенно растет, однако в детстве, как правило, не превышает 4,1 ммоль/л.

Диагностическое значение: Повышенная концентрация холестерина крови (гиперхолестеринемия) – это один из главных факторов

риска развития атеросклероза. При оценке зависимости смертности от ИБС и концентрации холестерина установлено, что смертность удваивается при увеличении концентрации холестерина с 5,2 до 6,5 ммоль/л, и увеличивается в 4 раза при концентрации холестерина 7,8 ммоль/л.

Европейское общество по борьбе с атеросклерозом разделяет уровень холестерина по степеням тяжести:

легкая гиперхолестеринемия – 200-250 мг/дл (5,2-6,5 ммоль/л), умеренная гиперхолестеринемия – 250-300 мг/дл (6,5-7,8 ммоль/л),

высокая гиперхолестеринемия – свыше 300 мг/дл (7,8 ммоль/л). Это имеет значение для оценки степени риска развития атероскле-

роза и ИБС и, соответственно, определения тактики ведения пациентов. Однако изолированное определение уровня общего холестерина в настоящее время не рекомендуется проводить, даже для скрининга. Как известно, общий холестерин представляет собой суммарную концен-

641