Методы мол-ген иссл

31

цепь ДНК нуклеотида-терминатора идентифицируют с помощью ПЗСматрицы как тип включенного нуклеотида, так и его положение. Затем терминирующая группа и флуоресцентная краска отщепляются от нуклеотида, и цикл синтеза повторяется. Эта серия шагов продолжается определенное количество раз, число которых задает пользователь.

Ионное полупроводниковое секвенирование основанное на технологии

PostLightTM, разработано компанией Ion Torrent и в настоящее время приме-

Суть этого подхода весьма проста и заключается в регистрации локального изменения рН на микрочипе в момент удлинения синтезируемой цепи ДНКполимеразой на ДНК-матрице. Первоначально ДНК фрагментируют, затем к концам полученных фрагментов лигируют специфические ДНК-адаптеры, необходимые для эмульсионной ПЦР на магнитных сферах и последующего секвенирования.

Одномолекулярное секвенирование проходит в специальных ячейках

(SMRT-ячейки) на прозрачной (кремниевой) подложке, с напыленным на нее слоем алюминия. В основе метода лежит использование технологии Zeromode waveruide. Сквозь дно в ячейку подается свет, однако благодаря особенностям ее строения, пучок фотонов не рассеивается, а освещает только конкретную часть (на подложке), где закреплена молекула phi29 ДНКполимеразы. Эта полимераза была выбрана в качестве «считывающего» фермента благодаря своей высокой точности, скорости синтезирования дочерней

и молекул ДНК или РНК через пору. При прохождении молекулы НК сечение поры (доступное для миграции ионов) уменьшается, в результате чего сила тока падает. Таким образом, считывая изменение силы тока, можно определять тип нуклеотида, проходящего через пору в конкретный отрезок времени.

32

5.ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ:

1)система санитарно-эпидемиологического контроля:

•диагностика инфекций;

•диагностика иммунных патологий;

•генетические исследования наследственных заболеваний;

•определение ГМИ пищевых продуктов;

2)ветеринария и растениеводство:

•инфекционные заболевания;

•определение видовой принадлежности;

3)наука:

•генная инженерия, микробиология, генетика и др.;

4)промышленность:

•определение биологического загрязнения (санитарный контроль);

5)судебная медицина:

•идентификация личности

6)ПЦР в генотипировании человека:

•исследование главного комплекса гистосовместимости человека (HLAтипирование). HLA-комплекс включает в себя область генов на 6-й хромосоме, которые кодируют HLA-антигены, участвующие в различных реакциях иммунного ответа.

•генетика наследственных болезней и мультифакториальных заболеваний - выявление генетических маркеров заболеваний и их определенных комбинаций.

•генетика репродукции - генотипирование супружеской пары и преимплантационная генетическая диагностика.

•иммуногенетика - изучение закономерности наследования антигенной специфичности различных тканей организма и роль генетических механизмов в осуществлении иммунологических процессов.

•онкогенетика - изучение роли генетических факторов в этиологии и патогенезе опухолей.

•фармакогенетика – молекулярно-генетическое изучение индивидуальной реакций организма на лекарственные средства.

33

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ КОНТРОЛЯ УСВОЕНИЯ ЗНАНИЙ 1.Метод ПЦР может использоваться для

1)диагностики хромосомных аберраций

2)молекулярной идентификации личности;

3)диагностики мутаций в генах наследственных болезней;

4)диагностики инфекций;

5)диагностики предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям.

2.Для работы ДНК-полимеразы необходимо наличие

1)однонитевой матричной ДНК;

2)инициирующего кодона;

3)двунитевого участка на 3'-конце молекулы;

4)4-х типов дезокситрифосфатов:

5)тРНК.

3.ПЦР представляет собой

1)искусственную амплификацию гена;

2)искусственный некомплементарный синтез ДНК;

3)амплификацию in vivo специфического фрагмента ДНК;

4)избирательный комплементарный синтез in vitro небольшого фрагмента ДНК;

5)искусственный синтез хромосом.

4.Одновременная амплификация двух и более искомых последовательностей ДНК в одной пробирке это

1)гнездовая ПЦР

2)ПЦР в реальном времени

3)мультиплексная ПЦР

4)ПЦР молекулярных колоний

5)групп-специфическая ПЦР

5.Этапом ПЦР не является

1)денатурация ДНК;

2)отжиг

3)достраивание цепей ДНК;

4)трансляция ДНК;

5)элонгация.

6.Фермент, используемый при амплификации ДНК

1)гиалуронидаза;

2)Таq-полимераза;

3)геликаза;

4)АТФ-синтетаза;

5)каталаза.

7.В ДНК-лаборатории отсутствует зона

1)выделения нуклеиновых кислот,

34

2)амплификации нуклеиновых кислот;

3)трасляции ДНК;

4)электрофореза нуклеиновых кислот;

5)детекции.

8.Праймер - это

1)искусственно синтезированные олигонуклеотиды, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени.

2)фрагмент ДНК, меченный различным образом и использующийся для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК и позволяющие идентифицировать комплементарные ему нуклеотидные последовательности.

3)термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.

4)смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов - «строительный материал», используемый Таq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

5)смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции амплификации, а также стабильное значение рН.

9.ДНК-зонд - это

1)искусственно синтезированные олигонуклеотиды, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени.

2)фрагмент ДНК меченный различным образом и использующийся для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК и позволяющие идентифицировать комплементарные ему нуклеотидные последовательности.

3)термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.

4)смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов - «строительный материал», используемый Таq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

5)смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции амплификации, а также стабильное значение рН.

10.Полимеразная цепная реакция - это метод

1)увеличения копий фрагментов ДНК;

2)позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК;

3)позволяющий изучить нуклеотидную последовательность ДНК;

4)изучения всего генома клетки;

5)исследований наследственного аппарата на клеточном уровне организации.

11.Реакционная смесь для амплификации в реальном времени не включает в себя

1) праймеры и зонды;

35

1)смесь дНТП;

2)буферный раствор;

3)ионы Mg2+;

4)ТЕ-буфер.

12.Отрицательный контроль необходим для выявления

1)загрязнения реакционных смесей

2)определения контаминацинии чужеродной ДНК

3)правильной работы реактивов

4)визуализации результатов амплификации

5)уменьшения числа побочных продуктов

13.Положительный контроль необходим для определения

1)правильной работы реактивов в реакционной смеси

2)выявления неспецифических продуктов амплификации

3)неспецифического взаимодействия компонентов реакционной смеси

4)визуализации результатов амплификации

5)гибридизации димерных продуктов

14.Детекция результатов ПЦР определяется с помощью метода

1)ПЦР в реальном времени

2)секвенировании

3)вертикального агарозного геля

4)гетеродуплексного анализа в акриламидном геле

5)инвертированной ПЦР

15.Полимеразная цепная реакция в реальном режиме времени это

1)метод детекции результатов амплификации

2)детекция накопления продуктов амплификации непосредственно во время проведения амплификации

3)метод использующий специальные ДНК-амплификаторы с оптическим блоком

4)вариант ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (более

1000 п.н.)

5)метод определения фрагментов ДНК

16.Метод вертикального электрофореза - это метод

1)детекции результатов

2)использующий агарозу

3)использующий токсичное вещество акриламид

4)использующий анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК

5)пиросеквенирование

17.Секвенирование это метод

1)определения нуклеотидной последовательности

2)с помощью которого возможно определить биологический возраст объекта по цепочке ДНК (пиросеквенирование)

3)основанный на химическом расщеплении ДНК по одному основанию

36

4)при котором можно использовать автоматические генетические анализаторы

5)позволяющий определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном

18.Новейший метод секвенирования ДНК – это метод

1)основанный на использовании полупроводниковых микрочипов

2)считывания изменение силы тока, при котором можно определять тип нуклеотида, проходящего через двухслойную мембрану с единичной порой

3)позволяющий определить последовательность полных геномов организмов

4)секвенирование путем синтеза ДНК

5)использующий анализ кривых плавления, когда сигнал флуоресценции возрастает пропорционально количеству продукта амплификации

Ответы на тестовые задания

ЛИТЕРАТУРА

Рекомендуемая

37

Основная

1.Гинтер, Е. К. Медицинская генетика : национальное руководство / под ред. Е. К. Гинтера, В. П. Пузырева, С. И. Куцева. – М.:ГЭОТАР-Медиа,

2022. – 896 с. ISBN: 978-5-9704-6307

2.Клиническая генетика : учебник / Н. П. Бочков, В. П. Пузырёв, С. А. Смирнихина ; под ред. Бочкова Н.П. – 4-е издание – М. : ГЭОТАР-Медиа,

2020. – 592 с. – ISBN 978-5-9704-1683-9. - Текст : непосредственный.

3.Медицинская генетика : учеб. пособие / Л. В. Акуленко [и др.]. – М. :

ГЭОТАР-Медиа, 2015. – 192 с.: ил. – ISBN 978-5-9704-3361-4. - Текст :

непосредственный.

Дополнительная

1.Иванов В.И. Учебник для ВУЗов «Генетика». Москва, ИКЦ Академкнига,

2006. – 638 с. ISBN 5-94628-146-1 - Текст : непосредственный.

2.Херрингтон, С. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. / С. Херингтон, Дж. Макги - М.: Мир, 1999. - 558 с. ISBN 5-03-003060-3. – Текст : непосредственный.

3.Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / под ред. чл.-корр. РАЕН А. Б. Масленникова. - Новосибирск: Академиздат,

2019. – 166 с. ISBN 978-5-6043238-1-6. - Текст : непосредственный.

4.Гинтер, Е. К. Медицинская генетика : учебник. – М., 2003. - 448 с. – ISBN 5-225-04327-5. - Текст : непосредственный.

Литература, использованная составителями

1.Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология: Принципы и применение. — М.: Мир, 2002. - 589 с. ISBN 5-03-003328-9 - Текст : непосредственный.

2.Зорина В.В. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР): методическое пособие. ООО «ДНК-Технология» - Москва, 2012. – 80 с. - Текст : непосредственный.

3.Каюмов А.Р. Практикум по молекулярной генетике. Учебнометодическое пособие / А.Р. Каюмов, О.А.Гимадутдинов – Казань: Казань, КФУ, 2016. -36 с. - Текст : непосредственный.

4.Основы работы в лаборатории молекулярно-генетических исследований : Учебное пособие для аспирантов, клинических интернов и ординаторов, врачей. / Лазарев К.Ю., Брайко О.П. – Краснодар, ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России, 2016. – 25с. - Текст : непосредственный.

5.Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28 января 2021 года N 4 «Об утверждении санитарных правил и норм СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней»» (с изменениями на

25 мая 2022 года). - URL : http : https://docs.cntd.ru/document/573660140

(дата обращения: 25.12.2023). - Текст : электронный.

38

6.ПЦР в реальном времени / Д. В. Ребриков [и др.] ; под ред. д. б. н. Д. В. Ребрикова. - М. : Лаборатория знаний, 2018. — 223 с. : ил. ISBN 978-5- 00101-085-2 - Текст : непосредственный.

7.NGS «высокопроизводительное секвенирование» / Д.В.Ребриков – Москва. БИНОМ. Лаборатория знаний 2015. – 235 с. ISBN 978-5-9963- 3024-9 - Текст : непосредственный.