УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ
”ПОЛЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ“
Факультет биотехнологический
Кафедра биохимии и биоинформатики
УПРАВЛЯЕМАЯ САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА № 4
на тему:
Выделение ферментов из биологического материала.
Методы определения активности ферментов
Подготовил |
|
Децук Валерия Петровна |
|||
Студент 2 курса, гр.22БХ-1 |
(подпись) __________________2023 |
||||
|
|
|
|
||
Проверил |
|
Аль Меселмани Моханад Али |
Доцент |
(подпись) ___________________2023 |
|
ПИНСК 2023
ОГАВЛЕНИЕ
Глава 1. Выделение ферментов из биологического материала 3
Глава 2. Методы определения активности ферментов 7 Глава 1. Выделение ферментов из биологического материала
Каждый отдельный фермент требует к себе особого внимания и подхода. Большинство ферментов выделяют при низких температурах во избежание инактивации. Существуют много способов выделения ферментов как в лабораторных условиях, так и в промышленности. Основные способы:
дезинтеграция,
экстракция,
осаждение (высаливание),
хроматография,
электрофорез.
Дезинтеграция клеток. в зависимости от локализации по отношению к клеточной мембране фермента бывают внеклеточные (экзоферменты), внутриклеточные (эндоферменты) и мембранные или клеточносвязанные. Если мы получили (вырастили) суспензию клеток или культуральную жидкость, ферменты будут по-разному распределятся в этой жидкости. Некоторые ферменты выделены клетками наружу и находятся в к/ж, некоторые сидят в стенках клеток, некоторые заключены в клетки. Ясно, что для выделения первых можно клетки не трогать, просто отделить, а вот для выделения 2-х и 3-х необходимо разрушить клетки.
Процесс разрушения клеточной стенки называют дезинтеграцией.
Существуют несколько методов дезинтеграции (разрушения).
механические: баллистический, экструзионный, декомпрессионный;
физические: осмос и термошоки, плазмолиз, криотехника, ультразвук, сушка, ионизирующая радиация, температура;
химические: действие кислот, щелочей, солей, органических растворителей, ПАВ, сдвиг рН;
энзиматические: действие литических ферментов (лизоцим;
биологические: действие фагов, антибиотиков.
Чаще всего первой стадией получение ферментов является получение гомогената. Гомогенат получают измельчением биологического материала (растительная или животная ткань, мицелий и т.д.) в ступке с добавлением песка или осколков стекла, или в специальных гомогенизаторах. В настоящие время применяют различные модели гомогенизаторов. Основной принцип работы этих аппаратов заключается в следующим: в стеклянном или металлическом стакане поступательно-вращательно перемешивается хорошо подогнанный к стенкам стакана металлический, стеклянный или фторопластовый шток. Предварительно измельченная биологическая ткань попадая между стенкой и штоком с наконечником механическим разрушаются. Подбирая обороты, тип гомогенизатора, среду можно выделить очень большой класс ферментов.
В последние время очень широко применяют УЗ-дезинтеграторы. Здесь также необходимо подобрать такие условия, чтобы исключить максимально инактивацию ферментов. Хорошим способом разрушения большинства микробных клеток является перематывание шариками, состоящие во встряхивании клеток с маленькими стеклянными шариками в быстро вибрирующем сосуде.
Дезинтегрирующие действие химических соединений заключается в нарушение меж. И внутримолекулярных связей между структурными элементами клеточной стенки за счет связывание ионов металлов, удаление липидов и т.д.
При энзиматической дезинтеграции можно выделять малоустойчивые внутриклеточные структуры. Ферменты или ферментные комплексы литического действия получают из бактерий, грибов, тканей животных и растений. Например, в состав дрожжелитического ферментного комплекса входят различные глюконазы, протеазы, хитиназы. Из-за различия в строение клеточных стенок в зависимости от рода, вида, штамма одних и тех же клеток, в каждом конкретном случае необходимо подбирать соответствующий ферментный комплекс. Особенно большой скачок в использовании энзиматической дезинтеграции был сделан после применение иммобилизованных ферментов.
Биологическая дезинтеграция осуществляется фагами, бактериоцинами вызывающих лизис клетки ведущий и распаду клетки. Если ферменты прочно связаны с внутриклеточными структурами, то вначале выделяют эти структуры дифференциальном центрифугированием, а затем экстрагируют из них ферменты органическими растворителями или водными растворами дозоксихолата, твина и т.д. (детергенты).
Для получения ферментного экстракта можно использовать буферные растворы, растворы солей, воду, смесь глицерина с водой (40% и 60%0, или органические растворители.
Раньше и сейчас для выделения ферментов чаще всего использовали ацетон и спирт. Несмотря на простоту этот способ имеет ряд недостатков. Не все ферменты выдерживают обработку органическими растворителями денатурируют и теряют свою активность. Поэтому эту операцию нужно проводить при очень низких температурах, близких к температуре замерзание смеси данного растворителя с водой.
Для очистки ферментов применяют водорастворимые полимеры. Их применение основано либо на осаждение ферментов полимерами (полиэтиленгликоль), либо на избирательном распределении ферментов в водных растворах 2-х несмешивающихся полимеров (декстран, полиэтиленгликоль).
Хроматографические методы очистки. Адсорбционная хроматография основана на различие в адсорбционных свойствах компонентов разделяемой смеси.
Главное требование, предъявляемое к адсорбенту для хроматографии – отсутствие химического взаимодействия между адсорбентом и анализирующим веществом. Адсорбент не должен оказывать каталитического действия как на растворитель, так и на компоненты разделяемой смеси. Для этого адсорбенты очищают от примесей, нейтрализуют его кислотные и щелочные свойства. Каталитическое окисление можно устранить, проводя работу в атмосфере инертного газа.
Второе важнейшие свойство адсорбента – избирательность по отношению к компонентам разделяемой смеси. Адсорбенты разделяют на полярные и неполярные. Адсорбционное сродство полярных веществ к полярным адсорбентам, значительно выше, чем неполярных к полярным.
Третье – размер частиц от которого зависит способность адсорбировать те или иные вещества.
Четвертое – стандартность свойств адсорбента, что обуславливает воспроизводимость и возможность сопоставить результаты.
Пятое – разделенные вещества должны легко отделяться от адсорбента. В хроматографических исследованиях применяют адсорбенты заводского производства. Один из наиболее распространенных адсорбентов окись алюминия, на которой удается храмотографировать широкий круг смесей как в полярных, так не полярных растворителях благодаря ее атмосферному характеру.
Техническая Al2O3 имеет слабощелочную реакцию (рН 9-10). Нейтральную Al2O3 готовят промывая ее азотной или соляной кислотой (разбавленной). Активность Al2O3 зависит от ее влагосодержания (увлажнение).