книги2 / 226

имеет 12 известных вариантов. Наиболее часто встречающиеся ге- нетические варианты бета-лактоглобулина– LGBА и LGBВ, они от- личаютсядвумяаминокислотнымизаменами:Asp64(LGBА)– Gly64 (LGBВ)иVal118(LGBА)– Ala118(LGBВ)и,соответственно,кодируются разными аллелями данного гена [44; 45]. Лактоглобулин является основным сывороточным белком жвачных животных. Установлена теснаявзаимосвязьмеждутехнологическимисвойствами­ ибиохими- ческимполиморфизмомбелковмолока.АллельBLGBгенабета-лак- тоглобулина связан с высоким содержанием в молоке казеиновых белковивысокимпроцентомжира,авариантBLGAхарактеризуется высокимсодержаниемсывороточныхбелков.Показанотакжевлия- ниегенотиповBLGнавеличинуудоев(коровысгенотипамиBLGAB иBLGBBхарактеризуютсяболеевысокимиудоями)[32].

Пролактин(PRL)– одинизсамыхуниверсальныхгормоновгипо- физасточкизренияегобиологическойактивности.Основнаяфунк- цияпролактинаумлекопитающих– стимуляцияразвитиямолочных желез.Он участвует в дифференцировке эпителиальных клеток мо- лочной железы, инициации и поддержании лактации, регуляции синтеза молочных белков и жиров.Таким образом,ген пролактина являетсяпотенциальнымгенетическиммаркеромпризнаковмолоч- ной продуктивности в животноводстве. У КРС ген PRL расположен на 23 й хромосоме и состоит из пяти экзонов и четырех интронов [32].Установлено,чтосинонимичнаяA-Gзамена,возникающаявко- доне для 103 аминокислоты, приводит к появлению полиморфного RsaI-сайта.ВисследованияхпоказанасвязьRsaI-генотиповгенаPRL уКРСспараметрамимолочнойпродуктивности.Коровысгенотипа- ми PRLBB по гену пролактина, по данным многих исследователей, являютсянаиболееобильномолочнымиижирномолочными,атакже имеютсамыйвысокийвыходмолочногожираибелка.

Соматотропин (гормон роста, GH)– важнейший регулятор, об- ладающийлактогенным,жиромобилизующимиростостимулирую- щимдействием.Изученыдваучасткаэтогогена:экзон4иинтрон3 [29; 46]. Полиморфизм в интроне 3, тестируемый с использованием рестриктазы MspI, оказался информативным для изучения связей с признаками молочной продуктивности. Полиморфизм экзона 4генаGHобусловлентранзициейС→А,чтоприводиткаминокислот- нойзаменевпозиции127(Leu→Val)вбелковомпродуктеиналичию/

11

отсутствию AluI– сайта в нуклеотидной последовательности гена. АминокислоталейцинсоответствуеталлелюAluI(+),авалин– AluI(–). Коровы,имеющиегенотипGHVV,почетвертомуэкзонугенагормона роста характеризуются более высокими удоями, а также выходом молочногожираибелка.МолококоровсгенотипомGHLL имеетбо- лее высокую жирномолочность. Коровы с генотипами GHDD имеют наибольший удой. Наличие аллеля GHD третьего интрона гена гор- монаростаявляетсянаиболееблагоприятнымсточкизренияхозяй- ственнойценностиибольшийвыходмолочногожирапосравнению сгенотипамиGHCC иGHCD[40;41].

Рядомученыхустановлено,чтоживотныесгенотипомLLобладали большейпродуктивностьювпериодпервойлактации.Приэтомвпо- следующиелактациипоколичествунадоенногомолокалидировали животныесгетерозиготнымгенотипомLV.Разницавколичествемо- локамеждугомозиготнымигетерозиготнымгенотипамизаразлич- ныепериодылактациисоставила2451,0кг(21,7 %).Поколичествужира вмолокенаблюдаласьдругаякартина:коровыизчислаобладательниц гетерозиготногогенотипаLVпревосходилиживотныхсгомозигот- нымгенотипомLLпомассовойдолежиравмолокена0,07 %[40;42].

Диацилглицерол-­ацилтрансферазу 1 (DGAT1) кодирует фермент, участвующий в синтезе триглицеридов. Полиморфизм этого гена оказываетвлияниенасодержаниевнутримышечногожиравмышцах животных. Ген DGAT1, содержащий QTL, маркирует продуктивные признаки племенного стада. Аллельный вариант K ассоциирован сповышеннымсодержаниемжира,втовремякаквариантAассоци- ировансвысокимиудоями.ДефицитDGAT1приводиткнарушению синтезажирныхкислотвжировойтканиискелетныхмышцах,атак- жесокращениюлактациивплотьдоееотсутствия.Ген,кодирующий диацилглицерол-­ацилтрансферазу1уBostaurus,известенкакDGAT1 и локализован в центромерном участке хромосомы 14 вместе с дру- гимигенами,определяющимимолочнуюпродуктивностьикачество молока. Изучение аллельного полиморфизма гена DGAT1 крупного рогатого скота позволило выявить в общей сложности около двух десятководнонуклеотидныхзамен,большинствоизкоторыхлокали- зованы в некодирующих участках гена и, таким образом,не влияет на структуру самого фермента. Исключением является динуклео- тидная замена GC > AA в экзоне 8 (позиция 10433/10434 в нуклеотид-

12

ной последовательности гена DGAT1 GenBank no. AJ318490), которая приводит к замене аминокислоты аланина лизином в позиции 232 (Ala232Lys).Исследования,проведенныенаразныхпородахкрупного рогатогоскота,выявилисвязьмеждуналичиемаллеля232Lysиповы- шеннымсодержаниемжиравмолоке,преобладаниемнасыщенных жирныхкислотпальмитиновойистеариновойнадненасыщенными, повышеннымсодержаниемвнутримышечногожираимраморностью говядины,пониженнымсодержаниембелковвмолокеиболеениз- ким удоем. Удой, количество молочного жира и белка за лактацию вышеуособейсгомозиготнымгенотипомАА.Авторыотмечаютпри этом превосходство коров с гетерозиготным генотипом гена DGAT1 (АК)поудоюзапервые100днейлактационногопериода.Крометого, результатыпоказали,чтотемпыростаиразвитияболеенизкиеужи- вотных,несущихвсвоемгенотипеаллельK. Какправило,такиеособи обладаютболеепозднимисрокамиосемененияивозрастомпервого отела,чтосказываетсянаихрентабельности[49].

Ген FASN, кодирующий синтазу жирных кислот, расположен на хромосоме 19 и включает 9 однонуклеотидных замен, ассоци- ированных с качеством молока. Замены g.17924A>G, g.13965C>T, g.16907T>C, g.18663T>C, g.8948C>T, g.14439T>C оказывают влияние насодержаниежираибелкавмолочнойпродукции,атакженаудой молока.В1 ми34 мэкзонахгенабылиобнаруженызамены763G>C и 16009A>G соответственно.Гомозиготные по данным заменам жи- вотныеимелиповышенноесодержаниежиравмолоке.Вэкзоне32 го гена FASN была обнаружена однонуклеотидная замена g.14726C>A, врезультатекоторойлейцинзамещаетсяизолейцином.Данныйал- лельный вариант влияет на уровень полиненасыщенных жирных кислотвмолоке.

БелокABCG2(ATP-bindingcassettesubfamilyGmember2)относит-

ся к суперсемейству АТФ-связывающих трансмембранных белков, участвующих в транспорте различных соединений через мембрану за счет гидролиза АТФ. Значимое влияние на качество молока ока- зывает однонуклеотидная замена A>C в экзоне 14 го гена ABCG2, приводящаякзамещениютирозинасериномвположении581.Аллель С связан с повышенным удоем и сниженным количеством белков; с повышенной частотой встречается у израильской голштинской породы(20 %).

13

Стеарил-­коэнзим-­А-десатураза 1 является ферментом, регули- рующим синтез мононенасыщенных жирных кислот,и кодируется геномSCD1.SCD1катализируетдесатурациюпальмитиновойистеа- риновойкислотсобразованиеммононенасыщенныхжирныхкислот (пальмитолеиновойиолеиновой).ГенSCD1крупногорогатогоскота расположен в 26 й хромосоме и состоит из 6 экзонов и 5 интронов. Вэкзоне5 гогенаобнаруженоднонуклеотидныйполиморфныйвари- антg.10329T>C(rs41255693),приводящийкзаменевалинааланином. Этоприводиткизменениюсоотношенияжирныхкислот– миросто- леиновой к миристиновой, а также влияет на содержание казеина

иостальныхбелковвмолоке.Отмеченослабоенегативноевлияние на удой молока. Дополнительно в 3’-некодирующей области SCD1 былообнаружено14замен,формирующихнесколькоразличныхга- плотипов,которыевлияютнасоотношенияразличныхнасыщенных

иненасыщенныхжирныхкислотвмолоке.

Микросомальная глутатион-­S-трансфераза (белок MGST1) отно- ситсяксемействуглутатион-­S-трансфераз,участвующихвдетокси- кацииксенобиотиков.MGST1катализируетконъюгациюглутатиона сэлектрофиламиивосстановлениегидропероксидовлипидов.Фер- мент локализуется в эндоплазматическом ретикулуме и наружной мембране митохондрий, защищая органеллы от окислительного стресса[58].ВинтронегенаMGST1былаотмеченаоднонуклеотидная замена(g.93945738C>T),влияющаянапроцентжираисоставмолока. АллельСассоциировансповышеннымсодержаниемжира,лактозы ибелковиснижениемудоя[44].

ЛептинкодируетсягеномLEPивыделяетсявкровьадипоцитами белойжировойткани.Лептинсвязываетсясрецепторомвголовном мозге и выполняет эндокринную функцию. Белок играет важную роль в гомеостазе и регуляции энергетического обмена, иммунных реакций,гемопоэза.Дляданногогенабылоотмечено,чтооднонукле- отидная замена A>T в 252 м положении связана со снижением удоя молока [60].Ген лептин (LEP) служит маркером,определяющим со- держаниевмолокежираибелка.ПроведенныйученымиПЦР-анализ коровпервойлактацииголштинскойпородыуказалнаполиморфизм генаLEP.ЖивотныесгомозиготнымгенотипомТТобладалибольшей молочнойпродуктивностью.

14

Ген тиреоглобулин (TG5) – один из самых крупных генов мле- копитающих– картирован в области центромеры 14 й хромосомы исостоитиз37экзонов.Структурныеразличиямежду5’-и3’-конца- мизначительны,этопозволяетпредположитьналичиедвухразных участковвмолекуле,экзон-­интронноесоотношениекоторыхравно: первый участок (30 kb ДНК)– 1: 10, второй (270 kb ДНК)– 1: 47. Про- мотор гена содержит участки, которые связывают специфические для щитовидной железы факторы транскрипции (TTF 1), а также ТТГ/цАМФ-чувствительный элемент. Он состоит из двух идентич- ных субъединиц, имеет 67 тирозильных остатков, но сайтами гор- моногенезаслужатлишьнемногиеизних.ГенTG5считаетсягеном-­ кандидатомдляQTL,оказываетвлияниенаспособностьнакапливать жиры.Геннаходитсявцентромернойобласти14 йхромосомы,онаже содержит QTL, имеющие связь с содержанием жира в молоке. Вы- явлена ассоциация генотипа TG5СT с жирномолочностью молока коров.ДляжелательногоTG5T-аллеляученыедоказалирецессивный типнаследования.

Это значит, что положительный эффект проявляется только тог- да, когда животное гомозиготно по аллелю TG5T. Таким образом, гомозиготный генотип TG5ТТ может обеспечить высокий уровень продуктивности молока и мраморности мяса. Анализ ассоциации полиморфизмагенаTG5сродительскиминдексомбыковпоказал,что материбыковголштино-­фризскойпороды,несущиегенотипTG5СТ, имелибольшийуровеньудоя,чемматерибыковсгенотипомTG5СС, на 24 кг. Матери быков черно-­пестрой породы, несущие генотип TG5ТТ,нетолькобылиобильномолочными,ноиимелинаибольший выходжира(464,7кг)ибелка(404,7кг).Анализбыковтатарстанского типа холмогорской породы не выявил достоверной разницы среди показателей родительского индекса у животных с различными ге- нотипамигенаTG5.

Средибыковзарубежнойселекциинаивысшимуровнемудояоб- ладалиживотные,несущиегомозиготныйгенотипTG5ТТ.В. Р. Хар- зинова установила, что коровы черно-­пестрой породы с генотипом TG5СТдостовернопревосходилисверстницсгенотипомTG5ССпоко- личествумолочногожирапоитогам2 йлактациина14,6кг(р<0,05). Исследованиямиприанализесвязимолочнойпродуктивностивза- висимости от генотипа по гену TG5 в группах животных швицкой,

15

сычевской и ярославской пород существенных различий не было выявлено. Таким образом, данных о взаимосвязи полиморфизма данногогенаспоказателямипродуктивностикрупногорогатогоскота относительномало.Всвязисэтимизучениеполиморфизмаданного генаиегосвязисмолочнойпродуктивностьюкрупногорогатогоскота имееттеоретическоеипрактическоезначение[46].

Внастоящее время в нашей стране не решен вопрос оценки ге- нофонда различных пород крупного рогатого скота по генотипам генов, ассоциированных с молочной продуктивностью и воспроиз- водительной функцией, в то время как информация о них является

уплеменных животных существенным фактором, который должен быть учтен при разведении породы, особенно в стратегии выбора быков для стада. Селекционер должен иметь полную информацию огенотипебыка,которыйиспользуетсявстаде.Использованиеметода ПЦР-ПДРФпозволяетпроводитьширокомасштабныеисследования генетического полиморфизма и отбор животных с желательными аллельнымивариантами[47;48].

Всвязи с вышеизложенным комплексная оценка результатов, полученных с помощью ДНК-технологий,в совокупности с показа- телямипродуктивностикоровдостаточноперспективна.Существует необходимостьсистемногопроведенияанализамолекулярныхмеха- низмовформированияпараметровроста,развитияимолочнойпро- дуктивностистадкрупногорогатогоскота.Даннаяработапозволит совершить эффективный выбор генов-­кандидатов для ассоциатив- ныхисследованийидальнейшегоихиспользованиявселекционно-­ племеннойработе.

16

2.ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДНК-МАРКЕРОВ,АССОЦИИРОВАННЫХ С ПРОДУКТИВНЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Использование процедуры генотипирования по отдельным генам илипулуSNP,отвечающимзаглавныеселекционныепризнаки(свы- сокой генетической изменчивостью), такие как молочная продук- тивность и фертильность, позволяет по 5–10 маркерам вести отбор животных и последующий подбор родительских пар в товарном производстве. Более детальная характеристика по полногеномным данным может быть более эффективно использована в племенном животноводстведлявоспроизводстваценныхгенотиповкоров.

Следует отметить, что выявленные к настоящему времени ДНК-маркеры не дают в основной своей массе масштабного улуч- шения процесса селекционной работы. При этом механизмы фор- мированияпоказателеймолочнойпродуктивностинамолекулярном уровненедостаточноизучены.

ВсвязисэтимкомплексноеизучениеиприменениеДНК-техно- логий в совокупности с показателями продуктивности и фертиль- ностью коров имеет явные перспективы.Возникает необходимость проведения более системного анализа молекулярных механизмов формированияпараметровмолочнойпродуктивностиивоспроизво- дительныхкачествплеменныхстадживотных.Этодаствозможность сделать рациональный выбор генов-­кандидатов для ассоциативных исследованийидальнейшегоихиспользованиявселекции.

17

2.1.Материали методыисследований

ИсследованияпроводилисьвФГБОУВОУральскийГАУв2021г.Вид животных: крупный рогатый скот. Объектом исследования явля- лась выборка крупного рогатого скота голштинской породы одного из племенных хозяйств Свердловской области.От животных опыт- нойгруппыосуществлялиотборкрови(n =144)ввакуумныепробир- ки, содержащие консервант К3ЭДТА, в объеме не менее 5 мл. ДНК выделялисиспользованиемнаборовДНК-Экстран 1(ЗАО«Синтол», Россия) в соответствии с инструкцией производителя с последую- щимхранениемвыделеннойДНКпри–20°C.ВыделениеДНКипо- следующее генотипирование выполняли на базе ЦКП «Биоресурсы

ибиоинженерия сельскохозяйственных животных» ФГБНУ ФИЦ ВИЖим.Л. К. Эрнста.

КачествоиконцентрациюДНКопределялиспомощьюфлуориме-

траQubit2.0(Invitrogen/LifeTechnologies,США)иcпектрофотометра NanoDrop8000(ThermoFisherScientific,США).Полногеномноегено-

типирование проводили с использованием чипов GGP Bovine 150K (Neogene/IlluminaInc.,США).ДляпроведенияGWAS-исследований использовалипакетGapitv.3.дляR имодельSUPER.

Для проведения анализа использовали полные данные учета запервуюлактацию.

Поиск референтных последовательностей (rs,reference sequence)

иуточнение их локализации проводили с использованием базы данных Ensembl (http://www.ensembl.org). Функциональные анно-

тации генов выполняли с использованием базы данных GeneCards (http://www.genecards.org).

Частоту встречаемости генотипов анализируемых генов рассчи- тывали путем соотношения количества коров из числа носителей генотипакобщемучислуживотныхвисследуемойгруппе.

GWAS-исследования проводили по данным за первую лактацию попризнакам:KO– кратностьосеменения,SP– сервис-­период,U305– удой за 305 дней первой лактации, F%– % жира, KgF– выход жира, PP– процент белка, KgP– выход белка, LW– живая масса в первую лактацию.

Показатели молочной продуктивности животных оценивали за305днейпервойлактациивсоответствиис«Порядкомиусловиями

18

проведения бонитировки племенного крупного рогатого скота мо- лочногоимолочно-мясногонаправленийпродуктивности»(приказ МинсельхозаРФ№379от28.10.2010г.).

Обработкуполученныхвэкспериментеданныхпроводиливпро- граммахMicrosoftExcel,Biostatisticsприрасчетеосновныхстатисти- ческих и биометрических показателей. При этом пороги статисти- чески достоверных различий определяли при * р < 0,05; ** р < 0,01;

***р<0,001.

Уособей,включенныхвэкспериментальнуюгруппу,производили отбор крови в вакуумные пробирки и выделяли ДНК. Полногеном- ное генотипирование проводили в образцах ДНК с концентрацией неменее20нг/мклисоотношениемA230/2601,8–2,0.

Анализ ридов проводили в программе GenomeStudio v. 2.0. Кон- тролькачествагенотипированиясоставил0,98–0,99.

Поокончаниианализаформировалифинал-­репорт,содержащий сведенияогенотипахпо141716SNP.Редактированиеданныхбиочипов для построения файлов адаптированного расширения (.ped, .map,

.fam,.bed,.bim) и фильтрацию данных осуществляли в программе Plink1.9.

2.2.ПроведениепредварительныхGWAS-исследований по поискугеномныхрегионов,ассоциированных с хозяйственнополезнымипризнакамиживотных

Полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) и геномная селекция(GS)являютсядвумяосновныминаправлениямигеномных исследованийв животноводстве.Из-забольшогообъемаисложно- сти геномных и фенотипических данных аналитические методы

исвязанные с ними программные пакеты часто совершенствуются. ДляGWASбылоразработаномножествостатистическихметодов

ипрограммныхпакетовдляповышениявычислительнойэффектив- ности,статистическоймощностииконтроляложныхсрабатываний. Для анализа данных нами были использованы 2 модели: FarmCPU

иBLINK.

Характеристикиуказанныхмоделейпредставленывтаблице1.

19

Проведенный анализ ассоциаций однонуклеодидных полимор- физмов с продуктивными качествами коров исследуемой выборки позволил установить SNP, с высокой степенью достоверности ассо- циированныесвыбраннымипризнаками(таблица2).

Таблица 2

Количество SNP, ассоциированных с признаками продуктивности в исследуемой выборке, со значением p< 0,01,

выявленное разными методами

НаибольшимколичествомSNP,значениеp длякоторыхсоставляет менее0,01характеризоваласьмодельFarmCP U.ЕдиницытакихSNP выделеныприиспользованииBLINK.

Были проведены полногеномные ассоциативные исследования сцельювыявленияметода,наиболееобъективноотражающеговзаи- мосвязьмеждугенотипомифенотипическимпроявлениемпризнаков молочной продуктивности и фертильности исследуемой выборки животных. В анализе были рассмотрены удой за 305 дней первой лактации,жирномолочность,белковомолочность,выходжираибелка в килограммах,а также кратность осеменения,продолжительность сервис-­периодаиживаямассавпервуюлактацию.

Нарис.1и2представленырезультатыанализаассоциацийоднону- клеотидныхполиморфизмовсудоемза305днейпопервойлактации коровисследуемойвыборки.

20