зывания с регуляторными белками, активирующими РНК-полимеразу, а регуляторные белки, в свою очередь, могут активироваться путем связывания с гормонами. Энхансер может обладать ткане- и видоспецифичностью.
В структурной области генов эукариот закодирована информация только об одном белке. Структурный участок имеет мозаичное («прерывистое») строение, т.е. кодирующие участки – экзоны чередуются с некодирующими последовательностями нуклеотидов – интронами (экзонинтронная организация).
Этапы транскрипции генов эукариот:
1 – инициация – соединение промотора с РНК-полимеразой, сборка сложного ферментного и белкового комплекса на регуляторных участках ДНК и начало процесса. РНК-полимеразы эукариот имеют большую молекулярную массу, чем РНК-полимеразы прокариот и состоят из 8-12 субъединиц. У эукариот имеется три разные полимеразы – РНК-полимеразы I, II и III, каждая из которых транскрибирует разные категории генов, а также особые РНК–полимеразы митохондрий и хлоропластов:
РНК-полимераза I – транскрибирует гены для рибосомальных РНК
(рРНК);
РНК-полимераза II – гены для синтеза белков (мРНК) и гены для малых РНК ядра (мяРНК);
РНК-полимераза III – транскрибирует гены для транспортных РНК (тРНК), рибосомальных 5S РНК, малых РНК и др.
2 - элонгация – синтез пре-иРНК – первичного РНК-транскрипта. 3 – процессинг и сплайсинг.
4 – терминация – остановка транскрипции.
У эукариот в процессе транскрипции вначале синтезируется большая молекула пре-иРНК - первичный РНК-транскрипт. В нем содержится ин-
формация и с экзонов, и с интронов. Затем в ядре клетки происходит посттранскрипционная модификация РНК – процессинг.
Процессинг включает следующие преобразования:
1) вырезание интронов.
101
2) сплайсинг – соединение экзонов.
Сплайсинг РНК происходит в ядре по мере образования РНК на ДНК-матрице. В число компонентов, катализирующих процесс сплайсинга, входят малые ядерные РНК (мяРНК) и десятки белков, обладающих ферментативной активностью, необходимых для эффективного сплайсинга. Эти белки, связанные с мяРНК, образуют рибонуклеопротеидные частицы (мяРНК) (рис. 5.9). Место соединения интрон/экзон узнается мяРНК. На границе интронов и экзонов существуют сигнальные последовательности нуклеотидов ГУ в области 5′-конца интрона и АГ в области 3′ конца. Структуры (мяРНК связанные с белком) затем собираются вместе, образуя более крупный комплекс, называемый сплайсосомой, которая отвечает за сплайсинг и удаление интронов. Экзоны «сшиваются», образуя в итоге зрелую молекулу иРНК, которая транспортируется из ядра в цитоплазму.
3)кэпирование 5’-конца цепи - образование «колпачка» ( кэпа) на ′5-конце иРНК путем присоединения к первому нуклеотиду трифосфат нуклеозида, содержащего гуанин связью 5′- 5′ (рис. 5.10). Кэп предохраняет мРНК от действия 5'-эндонуклеаз, когда она переходит в цитоплазму, а также обеспечивает узнавание мРНК малой субъединицей рибосомы.
4)Полиаденилирование 3’ участка иРНК -– присоединение последовательности, состоящей из 100-200 остатков адениловой кислоты — по- ли-А-хвост, который определяет стабильность мРНК и время ее жизни в клетке (см. рис. 5.10). Кроме того, у эукариот поли-А-хвост возможно способствует выходу мРНК из ядра в цитоплазму, а также необходим для регуляции транскрипции мРНК.
Альтернативный сплайсинг
Несколько экзонов, содержащихся в мРНК, могут сшиваться в разных комбинациях с образованием различных матричных последовательностей (рис. 5.11). Альтернативный сплайсинг позволяет организму синтезировать разные по структуре и свойствам белки на базе одного гена. Альтернативный сплайсинг может проходить разными способами:
1) с использованием разных промоторов при синтезе разных иРНК на
102
одной матрице ДНК. В этом случае образуются транскрипты, имеющие разные по длине 5'-концы и разное количество экзонов;
2)путем изменения положения точки начала транскрипции;
3)выбором различных экзонов из одинаковых иРНК.
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
Экспрессия генов начинается с момента связывания промотора с ферментом транскрипции – РНК-полимеразой. При позитивном контроле оператор находится перед промотором, регуляторный белок, присоединяясь к оператору, облегчает связывание с ним РНК-полимеразы, запуская, тем самым, транскрипцию. При этом регуляторный белок называется бел-
ком-апоиндуктором. При негативном контроле оператор находится по-
сле промотора, и, взаимодействуя с регуляторным белком, препятствует связыванию РНК-полимеразы с промотором, останавливая транскрипцию. В этом случае регуляторный белок называется белком-репрессором.
Рассмотрим классическую схему регуляции работы (экспрессии) генов прокариот на примере негативной регуляции (или негативного контроля) лактозного оперона у бактерии кишечной палочки E.coli. Эта схема была предложена французскими учеными Жакобом и Моно в 1961 г.
В состав лактозного оперона (lac-оперона) входят три структурных гена ( lас Z, lас Y, lac А). Продуктами структурных генов lас Y и lас Z являются ферменты, обеспечивающие транспортировку и расщепление лактозы, а продукт гена lac А превращает лактозу в алло-лактозу, связывающуюся с белком-репрессором и, следовательно, являющуюся индуктором лактозного оперона (рис. 5.12).
Белок-репрессор блокирует оператор, оперон не работает. Если в клетку поступает индуктор - лактоза, то он связывает белок репрессор. Оператор освобождается, происходит считывание информации с ДНК на мРНК, запускается биосинтез белка – фермента. Накопление фермента приводит к разрушению индуктора - лактозы. Белок репрессор освобождается, оператор блокируется и работа оперона останавливается.
Другой тип регуляции по типу репрессии обнаружен при изучении
103
триптофанового оперона. Этот оперон содержит гены ферментов, участвующих в биосинтезе аминокислоты триптофан. В отличие от лактозного, триптофановый оперон подавляется триптофаном: при наличии триптофана он изменяет конформацию белка-репрессора и позволяет ему связаться с оператором, транскрипция ингибируется (в данном случае триптофан - корепрессор, белок-репрессор — апорепрессор); в отсутствие триптофана белок-репрессор распадается на мономеры и становится не активен, оператор не заблокирован, РНК-полимераза связывается с промотором и начинает транскрипцию структурных генов, происходит синтез триптофана.
Как и у прокариот, регуляция транскрипции у эукариот опосредована ДНК - белковыми взаимодействиями. Белки позитивной и негативной регуляции связываются со специфическими областями ДНК и стимулируют, или ингибируют, транскрипцию. Группу таких белков называют транскрипционными факторами. Индукция генной экспрессии может быть обусловлена влиянием факторов внешней среды: температуры, света, а также действием факторов внутренней среды, таких как гормоны. У многоклеточных эукариот один тип клеток может подавать сигнал другому путем секреции гормонов. Гормоны циркулируют по телу. Разные гормоны проникают в разные клетки, вступая в контакт с соответствующими целевыми клетками и затем инициируют серию событий, которые регулируют экспрессию определенных тканеспецифических генов. В эмбриональный период развития особей гормоны являются одним из факторов дифференцировки клеток.
Схематично генная экспрессия у эукариот может регулироваться на нескольких уровнях:
1.Регуляция уровня компактизации молекулы ДНК в виде эухроматина или гетерохроматина. На этом уровне работают ферменты, модифицирующие белковые молекулы гистонов, что позволяет осуществлять доступ ферментов транскрипции к определенным генам. В настоящее время этому уровню придается все большее значение. Процессы модификации гистонов и метилирования ДНК изучает новое направление генетики —
эпигенетика (см. ниже).
2.Первичный контроль инициации транскрипции с участием регуля-
104
торных элементов ДНК и белковых факторов.
3.Регуляция формирования матричной РНК - процессинг транскрипта в зрелую мРНК. Различные формы мРНК обычно получаются из одного
итого же гена путем альтернативного сплайсинга.
4.Контроль с участием особых молекул малых интерферирующих РНК (миРНК от англ. small interfering RNA или siРНК), способных комплементарно связываться с подавляемым геном или его транскриптом -
интерференционной РНК.
РНК-интерференция — это способ управления активностью генов посредством коротких двухцепочечных РНК, их назвали малые интерфе-
рирующие РНК (миРНК от англ. small interfering RNA или siРНК). При этом происходит выборочная деградация или ингибирование трансляции определенных мРНК, комплементарных миРНК. МиРНК являются короткими двуспиральными молекулами РНК, состоящими из 21-23 пары оснований. Попадая в клетку молекулы миРНК дают сигнал работе ряда ферментов, которые разрезают комплементарную одноцепочечную мРНК на отдельные фрагменты и удаляют из нее подлежащие ликвидации участки. Содержащаяся в этих участках информация не передается рибосомам. РНК
– интерференция может разрушать генетический материал попадающих в клетку вирусов, уничтожает подвижные элементы его генома и участвует в регуляции экспрессии функциональных генов, блокируя их работу. Тем самым осуществляется особый вид внутриклеточного иммунитета с помощью молекул РНК. Также миРНК могут связываться с комплементарными участками ДНК и изменять структуру хроматина.
5.Контроль на уровне трансляции путем редактирования мРНК.
6.Контроль на посттрансляционном уровне.
Трансляция
Трансляция – важнейший этап реализации генетической программы клеток, в процессе которого информация, закодированная в первичной структуре нуклеиновых кислот, переводится в аминокислотную последовательность синтезируемых белков, так же относится к реакциям матрич-
ного синтеза. Трансляция (синтез белка) у эукариот происходит вне кле-
105
точного ядра в рибосомах в цитоплазме.
Трансляция включает 3 фазы: инициация, элонгация и терминация синтеза белка.
Инициация фаза начала синтеза полипептида (рис. 5.13-А). Рибосома в процессе трансляции выполняет ряд функций:
связывает и удерживает мРНК;
взаимодействует с аминоацил-тРНК, осуществляет синтез пептидной связи;
удерживает растущий полипептид, участвует в гидролизе ГТФ (гуанизинтрифосфата) и продвигается по мРНК, взаимодействует с белками – факторами трансляции.
В присутствии иРНК происходит объединение субчастиц рибосом, формируется рибосома, в составе которой различают пептидильный (П) и аминоацильный (А) центры. В аминоацильном А-участке располагается аминоацил-тРНК, несущая определенную аминокислоту. В пептидильном П-участке располагается тРНК, которая нагружена цепочкой аминокислот, соединенных пептидными связями. Происходит присоединение к рибосоме первой аминоацил-тРНК.
Ферментом, участвующим в реакции присоединения аминокислоты к тРНК в цитоплазме, является кодаза (т-РНК синтетаза). Процесс узнавания молекулой тРНК своей аминокислоты называется рекогницией.
У эукариот мРНК имеет только один участок начала трансляции. Первый от 5'-конца АУГ-кодон оказывается инициирующим. Он кодирует стартовую аминокислоту – метионин. Единственным общепринятым и универсальным сигналом инициации является кэп-структура. Основную роль в поиске и закреплении малой субъединицы на инициирующем кодоне играют эукариотические инициирующие факторы, которые образуют белковый комплекс, связывающий малую субъединицу рибосомы с кэпструктурой мРНК.
Элонгация удлинение полипептида (рис. 5.13-Б).
Внутри большой субчастицы рибосомы одновременно находятся
106
около 30 нуклеотидов мРНК и только 2 информативных триплета-кодона: один в А-участке, другой в П-участке. Молекула тРНК с аминокисло-
той вначале подходит к А центру рибосомы. В том случае, если антикодон т РНК комплементарен кодону иРНК, происходит временное присоединение тРНК к кодону иРНК. После этого рибосома передвигается на 1 кодон по иРНК, а тРНК с аминокислотой перемещается в П участок. К освобо-
дившемуся А участку приходит новая аминоацил-тРНК с аминокислотой и вновь останавливается там в том случае, если антикодон тРНК комплементарен кодону иРНК.
Основным ферментом, участвующим в образовании пептидной связи, является пептидилтрансфераза. Между аминокислотой и полипептидом в присутствии образуется пептидная связь и одновременно разрушается связь между аминокислотой и ее тРНК, а также между тРНК и иРНК. Освободившаяся от аминокислоты тРНК выходит из рибосомы в цитоплазму. Рибосома снова перемещается на 1 триплет.
Терминация завершение синтеза полипептида (рис. 5.13-В).
Когда на рибосоме появляется один из Стоп-кодонов мРНК (УАА, УАГ или УГА) синтез белка прекращается. Стоп-кодоны соединяются с особыми белками – релизинг-факторами. К последней аминокислоте сформировавшегося полипептида присоединяется вода и ее карбоксильный конец отделяется от тРНК. В результате пептидная цепь теряет связь с рибосомой, и вся структура рибосомы распадается. Синтезировалась полипептидная цепь – первичная структура белка.
Синтез однотипного полипептида в большом количестве происходит на полирибосомах (рис. 5.14).
Посттрансляционная модификация белка. Некоторые синтезиро-
ванные белки неактивны без последующего «созревания» – модификации. В процессе «созревания» белковые молекулы могут терять концевые аминокислоты, при участии фермента – экзопептидазы, преобразоваться во вторичную и третичную белковые структуры (рис. 5.15). Если полипептидные цепочки объединяются, могут образовываться четвертичные
107
структуры. Синтезированные макромолекулы могут объединяться с углеводами и липидами, встраиваясь в биомембраны.
В результате пострансляционной модификации белки приобретают специфические свойства и функциональную активность.
Классификация генов
Все гены по функциям подразделяются на структурные и функциональные.
1.Структурные гены несут информацию о белках-ферментах и гистонах, о последовательности нуклеотидов в различных видах РНК.
2.Среди функциональных генов выделяют:
-гены-модуляторы, усиливающие или ослабляющие действие структурных генов (супрессоры (ингибиторы), активаторы, модифика-
торы);
-гены, регулирующие работу структурных генов (регуляторы и
операторы).
Все клетки многоклеточного организма, возникая из зиготы путем митоза, получают полноценный набор генетической информации. Несмотря на это, они отличаются друг от друга по морфологии, биохимическим и функциональным свойствам. В основе этих различий лежит активное функционирование в разных клетках неодинаковых частей генома. Большая часть генома находится в клетках организма в неактивном, репрессированном, состоянии, и только 7-10% генов активны, т. е. транскрибируются. Спектр функционирующих генов зависит от тканевой принадлежности клетки, от периода ее жизненного цикла и стадии индивидуального развития организма.
Конститутивные гены, или гены «домашнего хозяйства» (от анг. housekeeping), обеспечивают функции, свойственные всем типам клеток. Эти гены кодируют белки общего назначения (гистоны, белки рибосом, тубулины и др.), тРНК, рРНК.
Индуцибельные гены или гены «роскоши» (англ. luxury) гены, обеспечивающие специализированные функции различным типам клеток.
Изменение условий может привести к активации «молчащих» генов и ре-
108
прессии активных. Дифференцированная экспрессия одного генома у млекопитающих обусловливает развитие огромного множества типов клеток.
ЭПИГЕНЕТИКА
Эпигенетика представляет собой изучение закономерностей наследования, которые связаны с механизмами, не затрагивающими изменение последовательности ДНК. Эпигенетические изменения сохраняются в ряде клеточных делений при митозе, а также могут передаваться следующим поколениям при мейозе. При этом, они не вызывают какихлибо изменений в последовательности ДНК и приводят к дифференциальной экспрессии генов. Один генотип, следовательно, может проявиться в виде разных фенотипов в зависимости от «эпигенетического статуса» определенного участка или нескольких участков ДНК.
Эпигенетика изучает механизмы, при помощи которых, на основе генетической информации, заключенной в одной клетке (зиготе), за счет различной экспрессии генов в различных типах клеток, может осуществляться развитие многоклеточного организма, состоящего из дифференцированных клеток. Все клетки организма в начале развития тотипотентны, способны развиваться в любую клетку тела, поскольку генетически идентичны. В ходе развития они приобретают разные свойства, например, одни становятся кардиоцитами, другие – нейронами. Это происходит в результате активации различных наборов генов в разных клетках. В дифференцированных клетках экспрессируются только гены, необходимые для их специфической деятельности. Клетки получают на определенных этапах развития разные (гормональные и др.) сигналы, которые направляют их на тот или иной эпигенетический «маршрут». Примерами эпигенетических изменений являются ДНК метилирование нуклеотидов и деацетилирование гистонов. Эти механизмы служат для подавления или усиления экспрессии генов.
Метилирование ДНК
Метилирование ДНК – это добавление метильных групп к специфическим участкам на ДНК, обычно к цитозину, за которым следует гуанин.
109
Почти 10% цитозина у высших организмов метилируется, он присутствует в Ц- и Г- парах, обозначаемых CpG (цитозин и гуанин, связанные фосфатом). В процессе участвуют ДНК-метилтрансферазы. Обнаружены белки, способные связываться с ДНК, содержащей метилированные нуклеотиды CpG (MeCPs). Эти белки вовлекают в процесс репрессорные комплексы, связывающиеся с метилированными промоторными участками. Метилирование ДНК ведет к подавлению экспрессии гена без изменения последовательности нуклеотидов в ней.
Мутации гена человека ДНМТ3В, (DNmt3b), кодирующего ДНКметилтрансферазу, вызывают заболевание, называемое синдром ICF (Immunodeficiency, Centromeric instability, and Facial abnormalities - cин-
дром иммунодефицита, нестабильности центромерного участка и лицевых аномалий.) В результате мутации гена MeCP2, расположенного на Х- хромосоме, у человека нарушается состояние гетерохроматина и развивается синдром Ретта – психоневрологическое заболевание, встречающееся почти исключительно у девочек.
Обратимые изменения в структуре хроматина
Вэухроматине гены доступны для транскрипции, в гетерохроматине
–нет. Локальная структура хроматина может обратимо изменяться с помощью различных механизмов, называемых «ремоделирование хроматина». Ремоделирование хроматина является активным обратимым процессом, с помощью которого гистоны, связанные с молекулами ДНК перемещаются, делая гены доступными для транскрипции. Необходимая энергия обеспечивается путем гидролиза АТФ в больших ремоделирующих комплексах.
Модификация гистонов
Ключевым событием в ремоделировании хроматина является модификация гистонов Н3 и Н4. Метилирование (добавление СН3-группы), ацетилирование (добавление ацетильных групп) и фосфорилирование (добавление фосфатных групп) являются основными типами модификации, которым подвергаются гистоны Н3 и Н4 по определенным аминокислотам в N-
концевых участках (хвостах). Это приводит к изменению свойств гистонов
110