541

K3[Fe(CN)6] и 10,6 г безводного карбоната натрия растворяют в мерной колбе на 1 л и доводят водой до метки.

Приборы: штатив с пробирками, «сахарные» стаканчики, микропипетки на 0,1 мл, воронки Ø 3-4 см, пипетки на 1, 2, 3, и 5 мл, микробюретки на 2 мл, водяная баня, вата, прокипяченная в дистиллированной воде (высушенная).

Ход работы.

Две пробирки метят карандашом (опытная и контрольная), в каждую из них наливают по 1 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия и по 5 мл 0,45% раствора сернокислого цинка. Выпадает белый осадок гидрата окиси цинка (Zn(OH)2), служащий для осаждения белков.

В опытную пробирку микропипеткой вносят 0,1 мл крови. Пипетку двукратно промывают содержимым пробирки, втягивая и выдувая жидкость. В контрольную пробирку кровь не добавляют, она служит для определения редуцирующих веществ, содержащихся в реактивах. Обе пробирки (контрольную и опытную) ставят на 3 минуты в кипящую водяную баню. В опытной пробирке белки свертываются и всплывают в виде серой массы. Затем содержимое пробирок фильтруют в широкие пробирки («сахарные стаканчики») через заранее промытую горячей водой вату. После того, как весь раствор профильтруется, пробирки трехкратно промывают горячей дистиллированной водой (по 2 мл). Чтобы раствор не затекал на наружную сторону пробирки, пользуются стеклянной палочкой. Полученные фильтраты употребляют для определения сахара. Для этого в каждую пробирку с фильтратом приливают точно по 2 мл 0,005н раствора железосинеродистого калия и помещают их в кипящую водяную баню точно на 15 минут.

Через 15 минут пробирки охлаждают, добавляют в них

71

по 3мл раствора йодистого калия с сульфатом цинка и по 2мл 3% раствора уксусной кислоты. Жидкость желтеет от выделившегося йода. В каждую пробирку добавляют по 2 капли раствора крахмала и титруют 0,005н раствором гипосульфита до исчезновения синей окраски. Титруют сначала контрольную, а затем опытную пробирки.

Расчет: содержание сахара в 0,1 мл крови вычисляют по таблице 2.4, составленной для 0,005н раствора гипосульфита.

В первом вертикальном столбце таблицы помещены целые и десятые доли миллилитров раствора гипосульфита, пошедшего на титрование, а в верхней, горизонтальной – сотые доли раствора гипосульфита. Число, оказавшееся на месте пересечения вертикальной и горизонтальной линий, проведенных от этих чисел, дает количество сахара в миллиграммах для данного количества гипосульфита. Из количества сахара, найденного для опыта, вычитается количество, найденное для контроля. Разность указывает на содержание сахара в мг в 0,1мл крови. Для пересчета на 100 мл крови полученное количество глюкозы в 0,1 мл крови умножают на 1000. Например, на титрование опыта пошло 1,32 мл гипосульфита. В первом вертикальном столбце находим цифру 1,3, а в верхнем горизонтальном ряду – цифру 0,02. На месте пересечения вертикальной и горизонтальной линий, идущих от этих цифр, находится число 0,120.

На титрование контроля пошло 1,84 мл гипосульфита. Находим по вертикали число 1,8, а по горизонтали – 0,04. На пересечении этих цифр находится число 0,027, что соответствует количеству сахара в контроле. Из опытного результата вычитаем контрольный: 0,120 – 0,027 = 0,093. 0,093 мг глюкозы содержится в 0,1 мл крови, следовательно, в 100 мл будет:

0,093 мгм × 1000 = 93 мг / %.

72

баню на 8 минут (точно!). Вода должна непрерывно кипеть. Затем пробирку охлаждают до комнатной температуры под водопроводной водой. Фотометрируют на ФЭКе при длине волны 580–650 нм (оранжевый или красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против контроля.

Контроль: 0,4 мл 20 % трихлоруксусной кислоты, 0,6 мл дистиллированной воды, 9 мл орто-толуидинового реактива (на две кюветы).

Параллельно готовят стандартную пробу. Стандартные пробы ставят, как опытные, но вместо безбелкового фильтрата крови берут 0,1 мл раствора глюкозы с концентрацией 50 мг%, 0,1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, 0,3мл дистиллированной воды и 4,5 мл орто-толуидинового реактива.

Расчет ведут по формуле:

где СОП - концентрация глюкозы в пробе, мг%; ЕОП – оптическая плотность пробы; ЕСТ – оптическая плотность стандарта;

50 – коэффициент для пересчета в мг% (стандартный раствор содержит 50 мг% глюкозы).

При исследовании крови свиней и лошадей целесообразно готовить стандартный раствор с содержанием 100 мг% глюкозы. В этом случае коэффициент для пересчета будет не

50, а 100.

Вопросы для самостоятельной работы:

1.Какие существуют особенности обмена углеводов у разных животных?

2.Внутриклеточный обмен углеводов (гликолиз, ЦТК, ПФЦ).

3.Какие бывают нарушения углеводного обмена и как его регулировать?

75

2.5.Контрольные вопросы

1.Общая характеристика углеводов, их роль в питании и жизнедеятельности организма.

2.Классификация углеводов.

3.Моносахариды, их типы и классификация по числу атомов углерода.

4.Триозы, их строение.

5.Характеристика и строение пентоз.

6.Характеристика и строение гексоз.

7.Общая характеристика и образование дисахаридов (мальтозы, лактозы, целлобиозы, сахарозы).

8.Общая характеристика полисахаридов, их классификация.

9.Характеристика, строение и роль крахмала, целлюлозы и инулина в питании животных.

10.Характеристика и строение гликогена.

11.Строение и роль в организме гепарина, гиалуроновой хондроитинсерной кислоты.

12.Переваривание углеводов у моногастричных животных.

13.Особенности переваривания углеводов у жвачных животных.

14.Пути использования всосавшейся глюкозы.

15.Роль печени в углеводном обмене.

16.Содержание гликогена в печени и мышцах.

17.Роль гликогена в мышечной ткани.

18.Глюконеогенез.

19.Пути расщепления углеводов в организме.

20.Гликогенолиз.

21.Гликолиз.

22.Цикл трикарбоновых кислот.

23.Пентозофосфатный путь окисления глюкозы, его роль в организ-

ме.

24.Регуляция углеводного обмена.

25.Действие инсулина на углеводный обмен.

26.Антагонисты инсулина по действию на углеводный обмен.

27.Нарушение углеводного обмена.

28.Гипогликемия, гипергликемия, глюкозурия.

76

3. БЕЛКИ, ОБМЕН БЕЛКОВ

Белки – высокомолекулярные органические соединения. Они играют огромную роль в жизнедеятельности клеток и тканей, являются важнейшей составной частью всего живого.

С белками в живом организме связаны важнейшие функции: рост и развитие клеток, пищеварение, размножение, мышечные сокращения, образование антител, перенос жизненно важных веществ и др. Биологические катализаторы

–ферменты являются белковыми веществами.

Всостав белков входят: углерод – 50,6 – 54,5%; кисло-

род – 21,5 – 23,5%; азот – 15,0 – 17,6%, водород – 6,5 – 7,3%, сера – 0,3 – 2,5%, фосфор – 0,5 – 0,6%.

Все белковые вещества разделяются на две группы: простые белки – протеины и сложные белки – протеиды. Простые белки при гидролизе распадаются только на аминокислоты. В состав сложных белков, кроме аминокислот, входят также вещества небелковой природы – нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, фосфорная кислота, металлы.

Впостроении молекул различных белков участвуют более 20 аминокислот, соединяющихся между собой пептидными связями. Все аминокислоты, встречающиеся в белках, относятся к категории α – аминокислот. Пептидная связь образуется при взаимодействии карбоксильной группы одной аминокислоты с аминогруппой другой путем отнятия молекулы воды:

Аминокислотная последовательность определяет первичную структуру белков.

Белки характеризуются особой пространственной конфигурацией, называемой вторичной, третичной и четвертичной структурой белка.

Полипептидная цепь свертывается в виде спирали за счет водородных связей, возникающих между атомами водорода – NН-групп (аминогрупп) и атомами кислорода –С-

Такая спираль называется вторичной структурой белка. Спирально скрученная полипептидная цепь упаковыва-

ется в виде глобулы или нитей за счет дисульфидных (-S-S-), ионных, эфирных связей и гидрофобных взаимодействий, стабилизирующих третичную структуру белковой молекулы. Четвертичную структуру имеют белки, состоящие из нескольких субъединиц (гемоглобин, некоторые ферменты и т.д.).

Пространственная конфигурация белков легко разрушается под влиянием различных физических и химических воздействий, при этом изменяются биологические и физикохимические свойства белков.

3.1. Качественные реакции на белки и аминокислоты

При взаимодействии белка с отдельными химическими веществами возникают окрашенные продукты реакции. Часть этих реакций обусловлена присутствием тех или иных атомных группировок, общих для молекул различных белков – это общие цветные реакции на белки. К таким реакциям относятся биуретовая и нингидриновая.

Другие реакции связаны с наличием в молекуле белка остатка той или иной аминокислоты и характерны только для белков, в молекулы которых входит данная аминокислота. С помощью этих реакций легко составить общее представление о качественном аминокислотном составе исследуемого белка. К таким реакциям относятся ксантопротеиновая, реакция Миллона, Адамкевича и т.д.

78

На основании цветных реакций разработаны методы количественного определения белков и аминокислот.

Вопросы для подготовки.

1.Каковы классификация и строение аминокислот?

2.Какова сущность полипептидной теории строения белков?

3.Уровни структурной организации молекулы белка, специфичность его строения.

Цель занятия:

изучить строение аминокислот, образование пептидной связи между аминокислотами. Разобрать первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры молекулы белка. Провести цветные реакции на белки и аминокислоты.

3.1.1. Биуретовая реакция на пептидную связь

В щелочной среде белки и полипептиды дают фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание с солями меди. Положительная биуретовая реакция проявляется у соединений, содержащих не менее двух пептидных связей. Интенсивность окраски зависит от длины пептида и варьирует от синефиолетовой до красно-фиолетовой и красной. Свое название реакция получила от биурета – соединения, которое образуется при нагревании мочевины:

(NH4)2SO4 препятствует биуретовой реакции.

Реактивы: гидроксид натрия 10% раствор; сульфат меди 1% раствор; раствор белка.

79

Приготовление раствора белка. Белок двух яиц смешивают с 1 л дистиллированной воды.

Приборы: штатив с пробирками, пипетки. Ход работы.

К 1-2 мл раствора белка прибавляют равный объем 10% раствора гидроксида натрия и несколько капель раствора сульфата меди. Появляется красно-фиолетовое или синефиолетовое окрашивание.

При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить, наслаивая на раствор белка в щелочи 1 мл 1% раствора сульфата меди. При стоянии на границе двух слоев появляется фиолетовое кольцо. Этот метод можно использовать для определения белка в моче.

Напишите реакцию образования трипептида.

3.1.2. Нингидриновая реакция

Нингидриновая реакция обусловлена наличием аминокислот, имеющих аминогруппы в α-положении. Растворы белка, α-аминокислот и пептидов при нагревании с нингидрином дают синее или фиолетовое окрашивание.

Сущность реакции заключается в том, что α- аминокислоты и пептиды, реагируя с нингидридом, подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию:

80