ЦИТОЛОГИЯ И ГИСТОЛОГИЯ

Цитология и гистология

характерно внедрение не только электронного микроскопа, но и других методов:

цито- и гистохимии;

гисторадиографии;

других вышеперечисленных современных методов.

При этом обычно используется комплекс разнообразных методик, позволяющий составить не только качественное представление об изучаемых структурах, но и получить точные количественные характеристики. Особенно широко в настоящее время используются различные морфометрические методики, в том числе автоматизированные системы обработки полученной информации с использованием компьютеров.

4. Объекты изучения цитологии и гистологии

Цитология - наука о строении, развитии и жизнедеятельности клеток. Следовательно, цитология изучает закономерности структурно-функциональ- ной организации первого (клеточного) уровня организации живой материи. Клетка является наименьшей единицей живой материи, обладающей самостоятельной жизнедеятельностью и способностью к самовоспроизведению. Субклеточные образования (ядро, митохондрии и другие органеллы) хотя и являются живыми структурами, но не обладают самостоятельной жизнедеятельностью.

Клетка - элементарная единица живого, состоящая из цитоплазмы и ядра и являющаяся основой строения, развития и жизнедеятельности всех животных и растительных организмов.

Гистология относится к морфологическим наукам, главной задачей которых является изучение структур живых систем. В отличие от анатомии, гистология изучает строение живой материи на микроскопическом и электронно-микроскопическом уровне. При этом изучение строения различных структурных элементов проводится в настоящее время с учетом выполняемых ими функций. Такой подход к изучению структур живой материи называется гистофизиологическим, а гистология нередко именуется как гистофизиология. Кроме того, при изучении живой материи на клеточном, тканевом и органном уровнях рассматривается не только форма, размеры и расположение интересующих структур, но методом цито- и гистохимии нередко определяется и состав веществ, образующих эти структуры.

Цитология и гистология

Непосредственными объектами изучения гистологии являются фрагменты тканей и органов, особым способом приготовленные для изучения их под микроскопом.

Объекты исследования подразделяются на:

живые (клетки в капле крови, клетки в культуре и другие);

мертвые или фиксированные, которые могут быть взяты как от живого организма (биопсия), так и от трупов.

В любом случае после взятия кусочков они подвергаются действию фиксирующих растворов или замораживанию. И в научных, и в учебных целях используются фиксированные объекты. Приготовленные определенным способом препараты, используемые для изучения под микроскопом, называются гистологическими препаратами.

Гистологический препарат может быть в виде:

тонкого окрашенного среза органа или ткани;

мазка на стекле;

отпечатка на стекле с разлома органа;

тонкого пленочного препарата.

5. Методы изучения. микроскопия

Основным методом исследования биологических объектов, используемым в цитологии и гистологии является микроскопирование, т. е. изучение препаратов под микроскопом. Микроскопия может быть самостоятельным методом изучения, но в последнее время она обычно сочетается с другими методами (гистохимии, гисторадиографии и другие).

Основные типы материала для микроскопии — срезы, мазки, сколы, смывы. Материал для исследования сначала фиксируют, затем обезвоживают, далее заливают в твёрдые среды, затем готовят срезы и производят окраску.

Фиксация сохраняет структуру клеток, тканей и органов, предотвращает их бактериальное загрязнение и ферментное переваривание, стабилизирует макромолекулы путём их химического сшивания. Существует несколько методов фиксации препаратов:

1.С помощью фиксирующей жидкости (формалин, спирты, глутаральдегид).

2.Криофиксация - обеспечивает мгновенное замораживание образцов в жидком азоте (–196 ºC).

3.Лиофилизация - быстрое замораживание и последующее высушивание

ввакууме.

Цитология и гистология

4.Обезвоживание – выдерживание препарата в спиртах возрастающей от 60° до 100° крепости.

5.Заливка – фиксация препарата в парафине, целлоидине, пластических средах и смолах.

6.Приготовление срезов (с помощью микротома). Виды микротомов:

-криостат - широко применяются в приготовлении срезов для экстренной диагностики новообразований у больных в момент удаления опухоли;

-ультратом (ультрамикротом) - автоматизированный прибор, позволяющий получать срезы из материала, залитого в смолу.

-вибротом - микротом с вибрирующим лезвием для получения тонких срезов фиксированных и нефиксированных тканей без замораживания называется вибротом.

Клеточные структуры, как правило, не различимы даже при большом увеличении микроскопа, они бесцветны и прозрачны. Для выявления тканевых компонентов, отдельных клеток и клеточных структур с 50-х годов прошлого века используют красители — лиганды с высоким сродством к различным компонентам ткани и с определёнными цветооптическими свойствами. Способность тканевых компонентов по-разному окрашиваться зависит от кислотно-основных (щелочных) свойств веществ, входящих в их состав. Для электронной микроскопии материал контрастируют солями тяжёлых металлов, используют преимущественно цитрат свинца и уранилацетат.

Микроскопия 1. Световая микроскопия

Увеличение — физическое свойство линз объектива и окуляра. Увеличение микроскопа приблизительно оценивают как произведение увеличения объектива и увеличения окуляра (рис. 1).

Специальные виды микроскопии

1.1. Темнопольная микроскопия. Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты. Наблюдаемый объект выглядит как освещённый на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи.

1.2. Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты. При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные — фаза световой волны, что и используют для получения

Цитология и гистология

высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии.

1.3.Поляризационная микроскопия — формирование изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы).

1.4.Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-

контрастной и поляризационной микроскопии и применяется для получения контрастного изображения неокрашенных объектов. Специальная интерференционная оптика (оптика Номарского) нашла применение в микроскопах с дифференциальным интерференционным контрастом.

1.5.Люминесцентная микроскопия применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. Основано на способности флюоресцирующих объектов поглощать свет одной длины волны и излучать в другой области спектра.

1.6.Сканирующий ближнепольный оптический микроскоп. В основе работы сканирующего ближнепольного оптического микроскопа лежит использование светового луча, диаметр которого меньше, чем длина волны источника, вследствие чего предел разрешения у такого микроскопа фактически отсутствует. Свет пропускают через субволновую диафрагму (отверстие с диаметром меньшим, чем длина волны используемого излучения). Исследуемый объект размещается непосредственно за отверстием

вближней зоне. Источник субдлинноволнового света размещают на расстоянии 10 нм и менее над объектом. Перемещая исследуемый объект или источник света (диафрагму с субволновым отверстием) в горизонтальном направлении, получают ближнепольное изображение поверхности образца, регистрируемое в виде распределения интенсивности оптического излучения в зависимости от положения диафрагмы.

2. Электронная микроскопия

2.1.В просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) вместо света применяют пучок электронов. При создаваемой высокой разности потенциалов (ускоряющем напряжении 50−600 кВ) электроны, составляющие пучок, имеют очень малую длину волны, что позволяет получать изображение изучаемого объекта с высоким разрешением. Теоретически разрешение просвечивающего электронного микроскопа составляет 0,002 нм. Реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0,1 нм. Для биологических объектов разрешение ПЭМ на практике составляет 2 нм.

2.2.Электронная томография. Этим методом с помощью серии микрографий, сделанных под разными углами, можно получить суммарную

Цитология и гистология

картину трёхмерной структуры исследуемого объекта (например, клеточных органелл).

2.3. Сканирующий просвечивающий электронный микроскоп

С помощью сканирующего просвечивающего электронного микроскопа изучают структуру поверхности объекта, сканируя её с помощью тонкого электронного луча (диаметром в несколько ангстрем). Микроскоп даёт возможность изучать молекулы при субнанометровом разрешении.

2.4.Сканирующие зондовые микроскопы позволяют получить изображение исследуемого объекта при его сканировании с помощью микроскопических игл ¾ зондов, имеющих очень острые окончания. Зонды могут быть различными: механическими, электрическими, оптическими, тепловыми и проч. К сканирующим зондовым микроскопам относятся атомносиловой микроскоп, сканирующий туннельный микроскоп, сканирующий ближнепольный оптический микроскоп, сканирующий тепловой микроскоп, сканирующий ионную проводимость микроскоп и др.

2.5.Атомно–силовая микроскопия позволяет получать трёхмерные изображения профилей поверхностей биологических объектов в нанометровом масштабе. С помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) можно исследовать размеры и конформацию как единичных молекул, так и их конгломератов, фиксированных к твёрдым поверхностям. С помощью АСМ можно манипулировать отдельными молекулами (например, перемещать их с места на место). В основе работы АСМ лежит сканирование поверхности изучаемого объекта с помощью тончайшего зонда (иглы).

2.6.Сканирующие туннельные микроскопы позволяют изучать структуру поверхности образца с разрешающей способностью до отдельных атомов. В основе работы микроскопа лежит использование т.н. туннельного эффекта. В его основе лежит явление прохождения электронов через барьер, образованный разрывом электрической цепи, — очень малым расстоянием (туннельным зазором), создаваемым между остриём зонда и электропроводящей поверхностью исследуемого объекта.

Отдельно выделяются лазерная конфокальная микроскопия и рентгеновская микроскопия

МЕТОДЫ РАБОТЫ С КЛЕТКАМИ

Клеточная, тканевая и органная культуры

Методы культивирования применяют для исследования функции изолированных живых клеток и тканей вне влияния регуляторных механизмов целостного организма. Следует помнить, что ситуации in vivo и in vitro не

Цитология и гистология

идентичны, клетки и ткани проявляют в этих состояниях различные свойства и по-разному реагируют на одинаковые воздействия.

Радиоавтография

В среду обитания клеток in vivo или in vitro вводят радиоактивный предшественник синтеза макромолекул. Радиоактивность поглотившей метку структуры регистрируют по восстановлению зёрен серебра в покрывающей препарат фотоэмульсии.

Цитофотометрия

Методы цитофотометрии предназначены для количественного определения различных веществ и их локализации в клетке по характеристическому поглощению этими веществами света определённого спектра.

Маркёры

Каждый клеточный тип и его фенотипы характеризуются экспрессией конкретных генов, в большинстве случаев различных между разными клеточными типами. Идентификация специфических для них признаков — маркёров — позволяет определить наличие конкретного клеточного типа (или фенотипов клеточного типа). Это обстоятельство широко используют в медицине для диагностики разных заболеваний (маркёры иммунные, опухолевые, ферментные и т.д.).

Раздел ЦИТОЛОГИЯ

ТЕМА 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТКИ

1. Общая характеристика клетки.

2.Химический состав и свойства биомембран.

3.Особенности строения клеток прокариот и эукариот.

4.Вирусы как неклеточная форма жизни.

1.Общая характеристика клетки

Цитология и гистология

тканей многоклеточных организмов. Содержимое клетки - цитоплазма. В каждой клетке имеется генетический аппарат. В ядерных клетках (клетках эукариот) он заключён в ядре, а в клетках, лишённых оформленного ядра (клетках прокариот), в нуклеоиде - ДНК содержащей зоне клетки, не отграниченной мембраной.

Ядерные клетки способны к самовоспроизведению. Размеры большинства эукариотных клеток ~10-100 мкм. Цитоплазма клеток содержит органоиды, которые выполняют многообразные функции. Во всех эукариотных (ядерных) клетках имеются следующие органоиды: в ядре - хромосомы, в цитоплазме -

рибосомы, митохондрии, эндоплазматическая сеть эндоплазматический ретикулум), комплекс Гольджи (аппарат Гольджи), лизосомы, плазмалемма

(внешняя клеточная мембрана). В большинстве клеток имеются волокнистые структуры, участвующие в осуществлении двигательных функций клетки и способствующие поддержанию их формы: актиновые нити

(микрофиламенты), микротрубочки и промежуточные филаменты. Все вместе они составляют цитоскелет клетки.

Важнейшие химические компоненты клетки - белки, в число которых входят ферменты. Белки содержатся как в клетках, так и во внеклеточных жидкостях организма, но синтезируются белки только в клетках.

Особенностью внутриклеточных процессов является их четкое

распределение по областям внутриклеточного пространства

(компартментализация). В частности, процесс клеточного дыхания у эукариот происходит только на мембранах митохондрий, синтез белка - только на рибосомах. Концентрирование ферментов в определенных областях, упорядоченное их расположение во внутриклеточных структурах разделяет разнородные процессы и согласует их в пространстве и времени. Гетерогенность структуры клетки обеспечивает возможность одновременного синхронного синтеза различных веществ из одних и тех же предшественников в миниатюрном общем внутриклеточном пространстве. Компактность, присущая метаболизму клетки, особенно ярко выражена в информативности структуры ДНК.

Внутри клетки непрерывно поддерживается определенная концентрация ионов, отличная от их концентрации во внеклеточной жидкости.

Клетки способны захватывать из среды крупные частицы, молекулы, включая белки (пиноцитоз) или даже вирусы и небольшие клетки (фагоцитоз). Это происходит за счет образования впячиваний плазмалеммы, заполненных внеклеточным субстратом. Края впячиваний затем замыкаются и отделяются внутрь клетки в виде пузырьков.

Цитология и гистология

Все клетки эукариот имеют сходный набор органоидов, по единым принципам регулируют свой метаболизм, запасают и расходуют энергию, используют генетический код для синтеза белков. Вместе с тем разные клетки организма имеют значительные отличия по размерам и форме, числу органоидов, набору ферментов. Эта особенность структуры клеток связана с

функциональной специализацией.

Доказано, что у всех клеток одного организма геном не отличается по объёму потенциальной информации от генома оплодотворённой яйцеклетки. Различия в свойствах клеток многоклеточного организма связаны с неодинаковой активностью генов. Это обусловливает различную дифференцировку клеток.

Во всех клетках активны гены общеклеточных, неспецифических функций. Именно потому неспецифических, сходных структурно-функциональных признаков и функций в разных клетках значительно больше, чем признаков и функций специфических. Клетки однородные и сходных функций образуют

ткани.

Воздействиями, регулирующими функции клеток, могут быть метаболиты клетки, ионы, действующие либо на гены, приводя к изменению количества фермента, либо на сам фермент, изменяя его активность. Регулирование может осуществляться по принципу обратной связи, когда результат регулирования (вещество, энергия) влияет на характер последующего регулирования. Регулирование обеспечивает устойчивость внутриклеточных процессов даже при значительных изменениях среды

клетки. Помимо неспецифических эндогенных химических механизмов регулирования функций клеток, в многоклеточных механизмах могут существовать экзогенные механизмы регулирования. В этом случае роль

регуляторов могут выполнять соседние однородные клетки. Это возможно при наличии непосредственных клеточных контактов или при опосредованных гуморальных воздействиях. Роль экзогенных регуляторов могут выполнять также клетки или совокупности клеток специализированные на выполнении функции регулирования (управления).

Основой самовоспроизведения эукариотных клеток является митоз. В некоторых тканях количество клеток устойчиво в течение всей жизни организма. В этих тканях делятся относительно малодифференцированные клетки, резерв которых поддерживается на относительно постоянном уровне, а одна из дочерних клеток дифференцируется. Например, у человека ежедневно погибает ~70 млрд. клеток кишечного эпителия (энтероцитов) и 2 млрд. эритроцитов. Во многих других тканях в клеточный цикл входят вполне

Цитология и гистология

дифференцированные клетки. Тогда митоз часто не завершается делением клетки, а ограничивается удвоением хромосом (полиплоидия) или вообще не начинается и клетка выходит из цикла после удвоения хроматид (политения). Некоторые ядра не входят в цикл воспроизведения в течение всей жизни дифференцированной клетки (нейроны, волокна скелетных мышц), и тогда продолжительность жизни клетки соответствует жизни организма. Во всех клетках происходит интенсивное обновление веществ и структур. Огромное количество клеток в каждой ткани, их постоянное внутреннее обновление обеспечивают надёжность работы органов и систем организма.

2. Химический состав и свойства биомембран

Состав и строение биологических мембран. Биологические мембраны состоят из белков и липидов. Углеводы присутствуют лишь в качестве составных частей сложных белков (гликопротеинов) и сложных липидов (гликолипидов). Нуклеиновые кислоты в небольшом количестве бывают ассоциированы с мембранами, но в состав мембранных структур не включаются. Вода составляет 20% от мембранного материала.

Согласно Сингеру и Никольсону, структурную основу биологической мембраны составляет двойной слой фосфолипидов, инкрустированный белками. При этом различают поверхностные (или периферические) и интегральные белки. Липиды находятся при благоприятных физиологических условиях в жидком агрегатном состоянии, это позволяет сравнить мембрану с фосфолипидным морем, по которому плавают белковые "айсберги". В разных мембранах соотношение между содержанием белков и фосфолипидов сильно колеблется: количество белков в миелиновой мембране в 2,5 раза меньше, чем липидов, а в митохондриях, напротив, белков в 2,5 раза больше, чем липидов. Кроме фосфолипидов и белков, в биологических мембранах содержатся и другие химические соединения. В мембранах животных клеток много холестерина (в сравнимом количестве с фосфолипидами и белками). Есть в мембранах и другие вещества, например, гликолипиды, гликопротеиды.

Жидкостно-мозаичная модель строения мембраны в настоящее время общепринята.

Липиды мембран представлены четырьмя основными группами: фосфолипидами (основная доля), сфинголипидами, гликолипидами и стероидами. Фосфолипиды – это сложные эфиры фосфатидной кислоты. Сфинголипиды, которые являются производными церамида и монофосфорных эфиров различных спиртов, представлены в основном сфингомиелином. Гликолипиды

Цитология и гистология

– гликозильные производные церамида – представлены как нейтральными цереброзидами, так и их кислыми сульфоэфирами – сульфатидами. Производные церамида и нейраминовой кислоты – ганглиозиды – часто выделяют в отдельную группу липидов – гликосфинголипиды. Стероиды представлены холестерином (в мембранах животных клеток), ситостерином (в растительных клетках) и тетрахименином (обнаружен у тетрахимены).

Белки взаимодействуют с мембранным бислоем, в результате чего они либо ассоциируются с поверхностью мембраны – периферические белки, либо пересекают бислой один или несколько раз, прочно интегрируясь в него,– это интегральные белки.

Участки белка, которые обращены во внеклеточную среду, могут подвергаться гликозилированию. В мембранах растений и бактерий полисахара играют самостоятельную роль, образуя наружную оболочку. В клетках животных, в которых наружный слой включает углеводы, имеется внутренний цитоскелет, состоящий из актина и других легко полимеризующихся белков; он имеет регулярную связь с мембранными белками и выполняет формообразующую и опорную функцию.

Фазовое состояние мембранных липидов. Мембранные липиды могут находиться в нескольких фазовых состояниях, т. е. они обладают мезоморфизмом. Два основных ламеллярных состояния, характерных для мембранных липидов в клеточных системах: кристаллическое и жидкокристаллическое – различаются плотностью упаковки и подвижностью находящихся в бислое белковых молекул.

Фазовые переходы мембранных липидов могут быть вызваны изменением температуры среды. Значение температуры, при котором наблюдается фазовый переход, называется критической температурой фазового перехода, или разделения фаз, если различные участки мембраны вследствие гетерогенности липидного состава по-разному отвечают на изменения температуры. Ионы Са2+, изменение числа ненасыщенных жирнокислотных цепей мембранных фосфолипидов и некоторые другие факторы также могут индуцировать фазовые переходы в бислое.

Специфические свойства биологических мембран. Благодаря указанным особенностям биологические мембраны имеют присущие им характерные черты. Они образуют протяженные бислойные структуры малой толщины (6–10 нм), объединяющие белковые и липидные компоненты с различными свойствами. Целостная структура мембраны создается за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий, а не за счет ковалентных связей между составляющими ее молекулами белков и липидов. Гидрофобный