Лабораторна робота №1

Лабораторна робота №1.

Якісні кольорові реакції на функціональні групи амінокислот та білків.

Мета роботи: засвоєння якісних реакцій на амінокислоти та білки.

Завдання на виконання роботи:провести якісні реакції на відповідні амінокислоти, пептиди та білки.

Лабораторний посуд: пробірки; піпетки.

Матеріали та реактиви: біуретовий реактив (1,5 г купрум сульфату, 6 г сегнетової солі, 300 мл 10%-го розчину натрій гідроксиду розчиняють в 1 л дистильованої води); 1%-ий розчин яєчного білка, 0,1%-го розчину α-аланіну або іншої амінокислоти, 0,5%-ий розчин нінгідрину, 0,1%-ий розчин тирозину, 4%-ий розчин гістидину, концентрована нітратна кислота, 10% та 20%-ий розчин натрію гідроксиду, 10%-ий розчин купруму сульфату, 0,2%-ий спиртовий розчин α-нафтолу, 2%-ий розчин натрію гіпоброміту, 5%-ий розчин плюмбуму ацетату, 0,1%-ий розчин цистеїну.

Існує два різновиди кольорових реакцій:

— Універсальні — біуретова (на всі білки) і нінгідринова (на всі α-амінокислоти та білки);

— специфічні — тільки на деякі амінокислоти як в молекулі білка, так і в розчинах окремих амінокислот.

Радикали амінокислот дають різноманітні забарвлення, що зумовлює можливість виявлення більшості з них певними кольоровими реакціями.

Дослід 1. Біуретова реакція на пептидну групу (реакція Піотровського)

У лужному середовищі в присутності йонів двовалентного Купруму розчини білків і пептидів набувають фіолетового забарвлення з червоним або синім відтінком залежно від кількості пептидних зв'язків. У сильно лужному середовищі пептидні групи поліпептидних ланцюгів переходять в енольну.

Хід роботи

1. Беремо три пробірки, нумеруємо їх і в кожну вносимо по 5 крапель:

• 1%-го розчину яєчного білка

• будь-якого дипептиду, наприклад гліцилгліцину або аланілаланіну

1. Добавляємо в кожну пробірку по дві краплі біуретового реактиву, ледь збовтуємо.

2. Спостерігаємо, чи утворюватиметься синьо-фіолетове забарвлення, дають пояснення (по кожній пробірці) і робимо висновки.

Результати

Пробірка	Досліджуваний розчин	Забарвлення	Пояснення
1	1%-ий розчин яєчного білка	Фіолетове	Яєчний білок містить пептиди, які при взаємодії з йонами Cu2+ утворюють біуретовий комплекс фіолетового кольору.
2	Розчин дипептиду	Блідо-синє	Діпептиди також містять пептиди, які утворюють біуретовий комплекс.

Висновки

Біуретова реакція є якісною реакцією на наявність пептидних зв'язків. Вона дає позитивний результат з білками, пептидами, біуретом, деякими амінокислотами та іншими сполуками при досить значній концентрації в розчині.

Пояснення

У лужному середовищі в присутності йонів Cu2+ розчини білків і пептидів набувають фіолетового забарвлення з червоним або синім відтінком залежно від кількості пептидних зв'язків. У сильно лужному середовищі пептидні групи поліпептидних ланцюгів переходять в енольну форму, яка взаємодіє з йонами Cu2+ і утворює забарвлений біуретовий комплекс.

При цьому енольна форма поліпептиду, утворена в сильно-лужному середовищі, дає негативний заряд, та її Оксиген, що взаємодіє з купрумом, утворює ковалентний зв'язок, а при взаємодії з атомами нітрогену, купрум утворює координаційні зв'язки.

Таким чином, наявність фіолетового забарвлення в результаті біуретової реакції свідчить про наявність пептидних зв'язків у молекулі досліджуваної речовини.

Дослід 2. Нінгідринова реакція на α-аміногрупу

Хід роботи

1. В одну пробірку наливають 5 крапель 1%-го розчину яєчного білка.

2. У другу пробірку наливають 5 крапель 0,1%-го розчину α-аланіну.

3. У третю пробірку наливають 5 крапель 0,1%-го розчину β-аланіну.

4. У всі пробірки приливають по 2 краплі 0,5%-го водного розчину нінгідрину.

5. Пробірки поміщають на водяну баню при температурі 70°С на 5 хвилин.

Спостереження

У всіх трьох пробірках після нагрівання утворюється синє або синьо-фіолетове забарвлення.

Пояснення

Утворення забарвлення пояснюється реакцією нінгідрину з амінокислотами. При нагріванні до 70°С амінокислоти перетворюються на альдегіди з виділенням амоніаку і вуглекислоти. Нінгідрин при цьому відновлюється:

R-CH(NH2)-COOH + H2NOH → R-CH(OH)-C=O + NH3 + H2O

Утворений альдегід взаємодіє з нінгідриновою групою нінгідрину, утворюючи барвник Руемана, який має синє або синьо-фіолетове забарвлення.

Хімізм реакції

R-CH(NH2)-COOH + H2NOH → R-CH(OH)-C=O + NH3 + H2O

R-CH(OH)-C=O + C6H5(NOH)2 → C6H5(NO)-C(R)=O + 2NH3

Висновок

Нінгідринова реакція є характерною для амінокислот, які мають вільну α-аміногрупу. Вона використовується для якісного та кількісного визначення амінокислот.

Додаткові відомості

Нінгідринова реакція є дуже чутливою і дозволяє виявляти навіть дуже малі кількості амінокислот. Вона також є досить специфічною і дозволяє відрізнити амінокислоти від інших органічних сполук, які мають вільні аміногрупи.

Дослід 3. Ксантопротеїнова реакція на ароматичне кільце циклічних амінокислот (реакція Мульдера)

Хід роботи

1. В одну пробірку наливають 5 крапель 1%-го розчину яєчного білка.

2. Додають до пробірки 3 краплі концентрованої нітратної кислоти.

3. Обережно нагрівають пробірку до появи забарвлення.

4. Потім пробірку охолоджують під струменем водопровідної води.

5. Додають краплинами 20%-ий розчин натрію гідроксиду, доки не почнеться зміна забарвлення.

Результати досліду

1. У першій пробірці з яєчним білком після нагрівання з нітратною кислотою з'являється жовте забарвлення. Після додавання лугу забарвлення переходить в оранжеве.

2. У другій пробірці з тирозином після нагрівання з нітратною кислотою також з'являється жовте забарвлення. Після додавання лугу забарвлення також переходить в оранжеве.

3. У третій пробірці з гістидином після нагрівання з нітратною кислотою забарвлення не змінюється.

Пояснення результатів досліду

Яєчний білок містить всі 20 амінокислот, в тому числі фенілаланін, тирозин і триптофан. Тому в першій пробірці з яєчним білком після нагрівання з нітратною кислотою відбувається нітрування ароматичних кілець фенілаланіну, тирозину і триптофану з утворенням динітропохідних. Ці динітропохідні мають жовте забарвлення. Після додавання лугу динітропохідні перетворюються на хіноїдні структури, забарвлені в оранжевий колір

Тирозин також містить ароматичне кільце, тому в другій пробірці з тирозином після нагрівання з нітратною кислотою відбувається нітрування ароматичного кільця з утворенням динітропохідних. Ці динітропохідні мають жовте забарвлення, яке після додавання лугу також переходить в оранжеве.

Гістидин не містить ароматичного кільця, тому в третій пробірці з гістидином після нагрівання з нітратною кислотою нітрування не відбувається. Відповідно, забарвлення не змінюється.

Хімізм реакції

Реакція нітрування ароматичних кілець циклічних амінокислот відбувається за наступним механізмом:

1. Нітратна кислота віддає електрон ароматичному кільцю, утворюючи нітроаніон.

2. Нітроаніон реагує з іншим електрофілом (наприклад, протоном), утворюючи нітропохідну.

3. Нітропохідна реагує з електрофілом (наприклад, протоном), утворюючи динітропохідну.

Динітропохідні циклічних амінокислот мають жовте забарвлення. Після додавання лугу динітропохідні перетворюються на хіноїдні структури, забарвлені в оранжевий колір.

Дослід 4. Реакція на тирозин (реакція Міллона)

Хід роботи

1. У першу пробірку наливають 5 крапель 1%-го розчину яєчного білка.

2. У другу пробірку наливають 5 крапель 0,1%-го розчину тирозину.

3. У третю пробірку наливають 5 крапель 0,1%-го розчину фенілаланіну.

4. У кожну пробірку додають по 3 краплі реактиву Міллона.

5. Обережно нагрівають пробірки на водяній бані (не вище 50°С).

Спостереження

• У першій пробірці з розчином яєчного білка після нагрівання з реактивом Міллона утворюється пурпурово-червоне забарвлення.

• У другій пробірці з розчином тирозину після нагрівання з реактивом Міллона також утворюється пурпурово-червоне забарвлення.

• У третій пробірці з розчином фенілаланіну після нагрівання з реактивом Міллона утворюється слабке пурпурово-червоне забарвлення.

Пояснення

Пурпурово-червоне забарвлення внаслідок реакції Міллона утворюється внаслідок утворення меркурієвої солі динітротирозину. Ця реакція відбувається за таким хімічним рівнянням:

HOC6H4CH2NH2 + Hg(NO3)2 + HNO2 → Hg(C6H4(NO2)2NH2)2 + 2HNO3

У цій реакції тирозин (HOC6H4CH2NH2) реагує з реактивом Міллона, який складається з меркурієвої солі нітратної кислоти (Hg(NO3)2) і меркурієвої солі нітритної кислоти (Hg(NO2)2). У результаті реакції утворюється меркурієва сіль динітротирозину (Hg(C6H4(NO2)2NH2)2), яка має пурпурово-червоне забарвлення.

Фенілаланін (C6H5CH2NH2) також здатний реагувати з реактивом Міллона, але внаслідок реакції утворюється більш слабка меркурієва сіль динітрофенілаланіну (Hg(C6H4(NO2)2NH)2), яка має слабке пурпурово-червоне забарвлення.

Висновок

Реакція Міллона є якісною реакцією на тирозин і білки, що його містять. Ця реакція також дає позитивний результат для фенілаланіну, але забарвлення в цьому випадку є слабшим.

Дослід 5. Реакція на гістидин

Хід роботи

1. До 0,5 мл 4%-го розчину гістидину приливають 1,5 мл води.

2. До отриманого розчину приливають 0,5 мл 10%-го розчину натрію гідроксиду.

3. Суміш нагрівають до кипіння.

4. До гарячого розчину додають краплю 10%-го розчину купруму сульфату.

5. Пробірку не струшують.

6. Спостерігають за утворенням забарвлення.

Результат

Після додавання купруму сульфату до гарячого розчину гістидину в лужному середовищі утворюється фіолетове забарвлення, яке поступово переходить у червоно-фіолетове.

Хімізм реакції

Гістидин є амінокислотою, яка містить у своєму складі іміногрупу (-NH-). У лужному середовищі іміногрупа амінокислоти взаємодіє з купруму сульфатом, утворюючи комплекс, який має фіолетове забарвлення.

Реакція:

R-CH(NH2)-COOH + CuSO4 + 4NaOH → R-CH(NH-)-COOH + Na2SO4 + 4H2O

де R - залишок амінокислоти.

Висновок

Реакція на гістидин з купруму сульфатом є якісною реакцією на наявність амінокислот, які містять іміногрупу.

Дослід 6. Реакція на амінокислоти, що містять слабозв'язаний сульфур (реакція Фоля)

Хід роботи

У дві пробірки влили по 10 крапель 5%-го розчину плюмбуму ацетату і краплями додали 20%-ий розчин натрію гідроксиду до розчинення попередньо утвореного осаду.

У першу пробірку додали 5 крапель 1%-го розчину яєчного білка. Суміш кип'ятили протягом 1 хвилини.

У другу пробірку додали 5 крапель 0,1%-го розчину цистеїну. Суміш кип'ятили протягом 1 хвилини.

Спостереження

У першій пробірці після кип'ятіння утворився чорний осад плюмбуму сульфіду.

У другій пробірці після кип'ятіння також утворився чорний осад плюмбуму сульфіду.

Пояснення

У першій пробірці яєчний білок містить амінокислоти цистеїн і цистин, які мають сульфгідрильні групи (—SH). Під час кип'ятіння в лужному середовищі сульфгідрильні групи гідролізуються, утворюючи натрію сульфід. Натрію сульфід у присутності натрію плюмбіту дає чорний осад плюмбуму сульфіду.

У другій пробірці цистеїн містить лише одну сульфгідрильну групу. Під час кип'ятіння в лужному середовищі сульфгідрильна група гідролізується, утворюючи натрію сульфід. Натрію сульфід у присутності натрію плюмбіту дає чорний осад плюмбуму сульфіду.

Рівняння хімічної реакції

У першій пробірці:

Pb(CH3COO)2 + 2NaOH → Pb(OH)2 + 2CH3COONa

Pb(OH)2 + 2NaOH → Na2PbO2 + 2H2O

Na2S + Na2PbO2 + H2O → PbS↓ + 4NaOH

У другій пробірці:

C6H12O2N2S + 2NaOH → C6H12O2N2 + 2NaHS

NaHS + Na2PbO2 + H2O → PbS↓ + 4NaOH

Аналіз одержаних результатів

Одержані результати свідчать про те, що в яєчному білку і цистеїні містяться сульфгідрильні групи, які здатні утворювати чорний осад плюмбуму сульфіду в присутності натрію плюмбіту.

Висновки і рекомендації

Реакція Фоля — це якісна реакція на сульфгідрильні групи в білках, пептидах і амінокислотах цистеїні та цистині.

Реакція проводиться в лужному середовищі. У першій пробірку вливають 10 крапель 5%-го розчину плюмбуму ацетату і краплями додають 20%-ий розчин натрію гідроксиду до розчинення попередньо утвореного осаду. Потім у першу пробірку додають 5 крапель досліджуваного розчину, а в другу — 5 крапель 0,1%-го розчину цистеїну. Суміші кип'ятять. У присутності сульфгідрильних груп утворюється чорний осад плюмбуму сульфіду.