2.3 Физико-химические методы исследования
2.3.1 Определение размера частиц, их полидисперсности и поверхностного
заряда
Средний размер наночастиц, их полидисперсность и
ζ-потенциал
определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии на приборах
Malvern Zetasizer 3000HSA (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK) при
температуре 298 К и при значении угла рассеивания 900, Zetanano (Malvern
Instruments) при температуре 298 К при значении угла рассеивания 1730, и
Мalvern Zetasizer Nano S90.
Полученные наночастицы выделяли осаждением на центрифуге (centrifuge;
Mistral 3000E (MSE) Serial No. S692/03/095, ultracentrifuge; Kontron Instruments.
Centrikon T-2060), сушили до постоянной массы на воздухе, затем в вакуумном
шкафу при 318 К.
Размер полученных частиц также определяли методами трансмиссионной и
сканирующей электронной микроскопии на трансмиссионном электронном
микроскопе марки CM 12 transmission electron microscope (Philips) и FEI Tecnai
20, type Sphera TEM instrument equipped with a LaB6 filament operating at 200 kV
при температуре -103 К и на сканирующем электронном микроскопе (СЭМ)
(Phenom, FEI company). Держатель сканирующего микроскопа с двух сторон
покрывали проводящей углеродной лентой, затем на нее помещали каплю
полученной эмульсии; образец сушили на воздухе, затем покрывали тонким
48
слоем золота.
Выход НЧ определяли гравиметрически.
Взвешивали пустые
-4
0,05 мл раствором наночастиц и выпаривали в сушильном шкафу в течении 2-х
часов при температуре 318 К, затем тигли снова взвешивали.
2.3.2 Определение молекулярной массы полимеров и их состава
Мокулярную массу полимера определяли методами гель-проникающей
хроматографии и масс-спектрометрии.
Полимер из эмульсии выделяли под вакуумом на приборе Freeze-drier
Christ. Alpha 1-4 LD plus Salmenkipp. Образцы готовили из полимерных
наночастиц, высушенных до постоянной массы, растворением их в
тетрагидрофуране.
Измерения молекулярной массы и молекулярно-массового распределения
полимеров проводили на приборах SEC 3 (“Alliance”) WAT270886 Waters 2695
(Singapore) Separations Module с УФ-детектором (a Waters 486 UV-detector), при
длине волны 254 нм (объем инъекции – 0,05 мл) и PerSeptive Biosystems,
Voyager-DETM STR, BiospectrometryTM Workstation.
Полученные полимеры также исследовали методами ИК- и 1H ЯМР-
спектроскопии и термогравиметрии. Образцы исследуемых веществ для ИК-
спектроскопии предварительно готовили с KBr. Измерения проводили на
приборе a Bio-Rad Infrared Excalibur 6000 FTIR spectrometer.
Для 1Н ЯМР-спектроскопии образцы готовили в дейтерированном
хлороформе (CDCl3). Измерения проводили на приборе Varian 400 MHz
spectrometer.
Термогравиметрический анализ полимеров осуществляли на приборе TGA
Q500 (Perkin Elmer Pyris 6) instrument в потоке азота (25 см3/мин), нагревая
образец со скоростью 283 К/мин. Масса образца – 4-5 мг. Нагревание
проводили в интервале температур 298-873 К.
2.3.3 Определение степени связывания лекарственного препарата
Степень связывания лекарственного препарата с полимером определяли
кондуктометрическим и УФ-спектрофотометрическим методами.
А) Предварительно в мерной колбе объемом 100 мл приготовили раствор
лекарственного препарата концентрации 100 мкг/мл в воде. Затем из
приготовленного раствора отбирали аликвоты, переносили в мерные колбы
объемом 25 мл и готовили серию растворов «Арглабина» с концентрациями 5.0;
10.0; 20,0; 40,0; 60,0; 80,0; 100,0 мкг/мл и фиксировали электропроводность.
Данные для построения калибровочного графика приведены в таблице 1.
Далее строили градуировочный график и по нему определяли
концентрацию несвязавшегося лекарства. Поскольку электропроводность
растворов является величиной аддитивной, определили электропроводности
компонентов системы и сделали соответствующие поправки. Степень
связывания препарата рассчитывали по разности исходного и несвязавшегося
49
алюминиевые тигли на весах с точностью 1*10 мг, наполняли каждый тигель
лекарственного вещества. Для концентраций лекарства 5-60 мкг/мл изменение
значений удельной электропроводности подчиняется линейному уравнению
у=86,353х+1,4692. Корреляционные коэффициенты равнялись 0,997.
Таблица 1
-
Данные для построения калибровочного
графика
диметиламиноарглабина гидрохлорида по электропроводности
Электропроводность растворов измеряли в термостатируемой ячейке (293
К) объемом 25 мл. на приборе Conductivity meter Type OK-102 (Hungary) №1182
и ООО «Эконикс-Эксперт», ИНН/КПП 7728209000/772801001 (Москва),
снабженный платиновыми электродами.
Б)
Количество лекарства в растворе определяли УФ-
спектрофотометрически на приборе U3000 Spectrophotometer (λ=204 нм)
(Hitachi). Растворы образцов пропускали через колонки Sephadex (Sigma
Chemical Co. DE-52) и промывали смесью этанол : вода в пропорции 1:5,7.
По полученным данным (таблица 2) строили калибровочный график (при
длине волны λ=204 нм) и расчитывали содержание несвязавшегося Арглабина.
В этом случае изменение значений характеризуется следующим уравнением y =
0,8266х-0,0254. Корреляционные коэффициенты равнялись 0,997.
Таблица 2 – Данные для построения калибровочного графика для «Арглабина»
Степень связывания лекарства с полимером определяли после
центрифугирования (13500 об/мин) наночастиц при комнатной температуре в
течение 1 часа. Измерения проводили на приборе Hewlett Packard 8453 UV-Vis-
spectrometer (89090A) при длине волны λmax = 268 нм.
Калибровочную кривую строили по данным, приведенным в таблице 3.
50
|
№п/п |
С («Арглабина»), мкг/мл |
-4 χпракт, ·10 , См/см |
-4 χтеор, ·10 , См/см |
|
1 |
5,0 |
2,343 |
2,014 |
|
2 |
10,0 |
2,67 |
2,333 |
|
3 |
20,0 |
3,51 |
3,088 |
|
4 |
40,0 |
4,59 |
4,707 |
|
5 |
60,0 |
7,461 |
7,946 |
|
6 |
80,0 |
13,16 |
12,953 |
|
7 |
100,0 |
28,1 |
27,375 |
|
№, п/п |
СЛВ, мг/мл |
Апракт. |
Атеор. |
|
1 |
0 |
0 |
0 |
|
2 |
0,125 |
0,136 |
0,13 |
|
3 |
0,25 |
0,250 |
0,26 |
|
4 |
0,5 |
0,450 |
0,52 |
|
5 |
1,0 |
0,841 |
1,04 |
Таблица 3
-
Данные
для
построения
калибровочного
графика
для
капреомицина сульфата
В работе использовали кварцевые кюветы толщиной 10 мм (2) марки No.
100-QS (Quartz Suprasil) (при длине волны λ=268 нм) и 2 мм (1) марки No. 110-
QX (Quartzglas Suprasil 300) (Hellma). В этом случае изменение значений
характеризуется следующим уравнением y = 26,516х-0,0048. Корреляционные
коэффициенты равнялись 0,9998 (10 мм) и 0,9997 (2 мм).
2.3.4 Определение содержания этанола методом газовой хроматографии
(ГХ)
Количество этанола, выделившегося в среду определяли на приборе Varian
450-GC Gas Chromatograph (Malasia), Model: CP-8400. S/N: GC0811B360
(Varian CP – Autosampler) при длине волны 211 нм. Калибровочную кривую
строли по данным, приведенным в таблице 4 (использовали кварцевую кювету
толщиной 2 мм).
Таблица 4 – Данные для построения калибровочного графика для этанола
По градуировочному графику расчитывали количество этанола,
выделившегося в систему. Изменение значений характеризуется следующим
уравнением y = 0,0006х-0,0002. Корреляционные коэффициенты равнялись
0,998.
2.3.5 Исследование деструкции полимолочной кислоты
вискозиметрическим методом
Навеску полимолочной кислоты, иммобилизованную стрептомицином (0,1
г) поместили в химический стакан, растворили в 10 мл дистиллированной воды
и оставили набухать на 24 часа. Затем вискозиметр Оствальда установили в
51
|
№, п/п |
СЛВ, мг/мл |
Апракт. |
Атеор. |
|
1 |
0 |
0 |
0 |
|
2 |
0,001625 |
0,03957 |
0,04 |
|
3 |
0,003125 |
0,07809 |
0,08 |
|
4 |
0,00625 |
0,15596 |
0,16 |
|
5 |
0,0125 |
0,32388 |
0,32 |
|
6 |
0,0250 |
0,66109 |
0,64 |
|
№, п/п |
СЭТ, мг/мл |
Апракт. |
Атеор. |
|
1 |
0 |
0 |
0 |
|
2 |
10 |
0,005832 |
0,005 |
|
3 |
25 |
0,013354 |
0,0125 |
|
4 |
50 |
0,027463 |
0,025 |
|
5 |
100 |
0,056182 |
0,050 |
термостате, нагретом до 310±0,1 К, и через широкое колено вискозиметра
налили 10 мл исследуемого раствора и проводили измерения времени
истечения испытуемых растворов. Затем измерения осуществляли через
определенные промежутки времени.
В качестве растворителя использовали бидистиллированную воду.
Для определения вязкости раствора полимера измеряли время истечения
равных объемов раствора (τ) и растворителя (τ0) через капилляр визкозиметра.
Относительную вязкость рассчитывали по формуле:
от н
0