ГИ-2
.docxСоңғы жылдары биотехнологияның үлкен өріс алуы генетиканың жаңа жетістіктеріне байланысты. Нақты айтқанда, қазіргі биотехнологияның көптеген салалары генетикалық инженериямен, әсіресе ген инженериясымен тікелей немесе жанама байланысқан. «Биотехнология» ұғымының өзі генетикалық инженерияның қалыптасуына байланысты пайда болды және алғашқы кезде бұл екі ұғым синонимдер ретінде қаралды. Алайда, уақыт өткен сайын бұл ұғымдардың мазмұны әр түрлі толықтырылды, дегенмен генетикалық инженерия биотехнологияның құрама бөлігі болып қалды.
Генетикалық инженерия - жаңа генетикалық қасиетттері бар организмдерді құрастыру тәсілдерін жетілдіретін ғылыми өрістңің саласы болса, ал биотехнология — өндірістің саласы.
Генетикалық-инженериялық әдіс арқылы құрастырылған жаңа организм биотехнологиялық өндірісте қолданылуы мүмкін. Бұл генетикалық инженерия мен биотехнологияның арасындағы ортақ жаңасу нүктелерін сипаттайды, мұндай байланыстың аяғында жаңа сапалы нәтиже пайда болады. Көптеген ғылым жетістіктерін биотехнологиялық өндірісте пайдалану жаңа сапалы нәтижеге әкелмейді, сондықтан да олар биотехнологияның саласы бола алмайды.
Жаңа биотехнологияның дамуы ең алдымен ген инженериясына байланысты екендігін біз білеміз, бұдан басқа ол клетка инженериясының жетістіктеріне де тікелей байланысты. Енді біз жаңа биотехнологияның осы екі әдісінің генетикалық бағыттарына және олардың медицина мен мал шаруашылығындағы мәніне жеке тоқталамыз.
Соматотропин гормонын өндіру. Соматотропин гормоны туралы түсінік. Инсулиннен кейін ген-инженерлік фармакология соматотропин деп аталатын өсу гормонын бактериялық клеткада синтездеуді шындап қолға алды.
Адамдарда соматотропин гипофиздің алдыңғы бөлігінде синтезделеді, оның жетіспеушілігі гипофиздік ергежейлілікке әкеледі. Көп уақыт бойы соматотропинді өліктерден бөліп келді. Алайда, дамыған елдерде осындай жолмен бөлінген гормон гипофиздік ергежейлілікпен ауыратын адамдардың тек үштен біріне ғана жеткілікті болды. Бұдан басқа, өліктерден бөлінген гормонның қоспасы көп болғандықтан, препарат қабылдаған аурулардың 30%-і гормонға қарсы антизаттар синтездейді, мұның өзі гормонның активтілігін жоққа шығарды. Гипофиздік материал баяу дамитын вируспен зақымданған деген де қауіп болды (гормон қабылдаған 4 адамның Крецфельдт-Яқоб ауруынан өлуіне байланысты), сондықтан соматотропин қабылдаған балаларды көп жылдар бойы бақылауға алуға тура келеді.
Ген инженериясының әдістері арқылы арнайы құрастырылған бактерия клеткаларында түзілген өсу гормонының айқын артықшылықтары бар: препараттар биохимиялық тұрғыдан таза, инфекциялық вирустар жоқ және көп мөлшерде синтездеуге болады. Швецияның «Каби витрум» фирмасы 1978 ж. «Генентек» компаниясымен ген инженериясының әдісі арқылы соматотропинді синтездей алатын бактерия штамын алу үшін келісімге қол қойды. Сегіз айдан соң «Генентек» фирмасының зерттеушілері — Дж. Геддель және т. б. соматотропинді синтездей алатын Е. СоІі К12 штамын алды. Алайда, алынған синтетикалық гормонның N — ұшында метиониннің қосымша қалдығы болды. 1980 ж. «Генентек» компаниясының зерттеушілері қосымша метионині бар синтетикалық гормонның биологиялық активтілігі табиғи соматотропиннен кем түспейтін дәлелдерін FDА-га ұсынды.
1985 ж. соңынан бастап «Каби Витрум» компаниясы өсу гормонын сомтрем деген аталумен Стренгнестегі өзінің зауыттарының ферментерлерінде (әрқайсысының сыйымдылығы 1560 л) кең өңдірістік масштабта шығаруда. Мұнда, 7 сағат ішінде 1 л бактериялық культурадан алынған гормонның мелшері 60 өліктің гипофизінен алынғанға эквивалентті. Бұл гормонды қолдану нәтижесінде адам бойының жылдық өсуі 8-18 см тең болды. Ал, 1987 ж. «Эли Лилли» компаниясы рекомбинантты ДНҚ негізінде метионині жоқ яғни табиғи гормоннан айнымайтын өсу гормонын өндірістік негізде шығаруды бастады. Бұл, 191 амин қышқылынан тұратын синтетикалық гормон хуматроп деген коммерциялық аталуымен белгілі.
Қазіргі кезде Жапония, Канада, Англия және Францияда рекомбинантты соматотропинді бактериялық клетка арқылы өндірістік жағдайда өндіру кең жолға қойылған. Рекомбинантты ДНҚ әдістерін пайдаланып, организм өсуінің басқа факторларын (соматостатин, соматомедин т. б.) синтездеуге болады. Соматостатин генінің өнімін Е. Соlі клеткасына лак-оперонды қолданып, бөлу мүмкіндігін біз жоғарыда талқылаған болатынбыз. Адамда гипофиздің аденомсында акромегалия ауруы (жақ және жіліктердің шеміршек ұштарының сәйкессіз өсуі) дамиды. Аурудың себебі ретінде соматотропиннің мөлшерден тыс синтезделуінен болады. Міне, осындай ауруды рДНҚ негізінде алынған соматостатинмен емдеудің пайдасы өте зор.
Мал шаруашылығындағы ген инженериясының маңызды жетістіктерінің бірі болып ген-инженерлік соматотропинді зоотехнияда қолдану саналады. Бұл күрделі полифункциялық белок мал шаруашылығында екі бағытта қолдану алды: 1) малдың өсуін стимуляциялау үшін (соматогендік активтілік); 2) сүт бездерінің қызметін жақсарту үшін (лактогендік активтілік).
Яғни соматотропин препараты малдың өсуін жеделдету және сауын сиырдың сүттілігін жоғарылату үшін қолданылады. Өсу гормонының соматогендік пен лактогендіктен басқа екі физиологиялық активтілігі бар: инсулиндік және диабеттік. Қазіргі кезде соматотропиннің рекомбинантты ДНҚ технологиясының мақсаты — өсу гормонының бар ғана активтілігінің биотехнологиялық өнімін алу. Мысалы, гормонның N — ұшының алғашқы 150 амин қышқылдарынан айырылған соматотропиннің туындылары алынды. Бұл туынды организмнің өсуін жеделдете алады, ал оның инсулиндік және диабеттік активтілігі байқалмайды. Гормонды соматогендік және лактогендік бөліктерге бөлу тәжірибелері де ойдағыдай өтті.
Әр түрлі текті соматотропиндер өздерінің бірінші құрылымы бойынша бір-біріне өте ұқсас, бірақ оларға түр ерекшелік тән. Басқаша айтқанда, сиырдың гормондық активтілігін күшейту үшін оған тек ірі қара малдан құрастырылған соматотропиннің рекомбинантты ДНҚ-сының өнімін ғана енгізу керек. Малдарға адам соматотропинін енгізу арқылы организмнің өсуіне физиологиялық әсер еткенімен, оның активтілігі күткен нәтижені бермейді.
Физиологиялық активті жетілген соматотропиннің молекулалық массасы - 22 кД және әр түрлі мал түрлерінде 190-195 амин қышқылдарынан құралған. Гормон, алдымен гипофизде прогормон түрінде синтезделеді. Ерекше протеазаның әсерінен прегормонның N — ұшынан 25 амин қышқылынан құралған, сигналдық тізбек деп аталынатын оның гидрофобтық ұшы ажырайды.Қалған полипептидтік тізбек жетілген соматотропинге сәйкес келеді.
Мал түліктерінде соматотропин генінің клонын алу азғана өзгеріспен адамның осындай генінің рДНҚ-сын алу үлгісіндей өтті (П. Баттери және т.б., 1986). Соматотропин геніне экзон-интрондық ұйымдастырылу тән болгандықтан және геннің бактерия клеткасындағы экспрессиясын алу үшін, иРНҚ негізінде кДНҚ көшірмелері алынды. Геддель әдістемесі бойынша генді Нае III рестрикциялық ферментімен үзіп, 531 н.ж. құралған ДНҚ тізбегін алды. Бұл бөлік сигналдық тізбегі жоқ жетілген гормонды ғана коделейді. Алайда, малдың басқа физиологиялық активті белоктарын жетілген полипептидтік тізбек арқылы тікелей микробиологиялық синтездеу мүмкін болғанымен, мұндай әдісті соматотропинді синтездеуде қолдану мүмкін емес, өйткені бактериялық тасығыш-белокты соматотропиннен айыру қиын (химерлі белокты - бактериялық белокты, белок-соматотропиннен метионин бойынша бромцианнан айыруға болмайды, өйткені соматотропиннің құрамында метионин қалдықтары бар) гормонның түререкшелік әсері бұзылуы мүмкін. Сондықтан қтДНҚ-ға, оның бактериялық клеткадағы жұмысын қамтамасыз ететін прокариоттық реттеуші элементтер жалғанады, бұл сонымен қатар соматотропин молекулаларын еркін мономерлі түрде алуға мүмкіндік береді.
Соматтотропин молекулаларын прегормон фирмасында алу да ыңғайлы. Ол үшін жетілген гормон генінің ұшына реттеуші элементтермен қатар белгілі тізбекті коделейтін синтетикалық тізбекті жалғайды. Синтетикалық тізбек Геддель Әдістемесі бойынша 84 н.ж. құралған және химиялық жолмен синтезделеді. Соматотропиннің немесе оның прегормон формасындағы генін Е. СоІі клеткасына енгізіп, зоотехния үшін аса пайдалы препараттар алады.
Өсу гормонын өндірудің маңызы. Қазіргі кезде ген-инженерлік әдіс арқылы ірі қараның, қойдың, шошқаның және тауықтың соматотропин гені алынды және оның Е. СоІі клеткасындағы клонын алу және экспрессиясы іске асты. Мұқият жүргізілген зерттеулер ірі қараның бактериялардан алынған соматотропині сауын сиыр сүттілігінің артуына ықпал ететінін дәлелдеді. Малға тәулігіне 13,5-тен 40-5 мг дейін соматотропинді енгізгенде, сиырдан алынған сүт мөлшері препараттың мөлшері мен малдың күтіміне байланысты 10-нан 50%-ке дейін көтерілді. Осы биотехнологиялық өнімді ірі қара сүт шаруашылығында жаппай қолдану кейбір ғалымдардың (Т. Аткинсон және т.б., 1985; Д. Бауман, Мак Гутчеон, 1985) пікірі бойынша сиыр сүттілігін орта есеппен 23-31%-ке көтереді. П. Баттери өз қызметкерлерімен (1980) ұзақ уақыт бойы (188 күн) соматотропин қабылдаған сиырлар сүтінің сапасы бақылау тобынан ешқандай айырмашылығы жоқ екендігін дәлелдеді. Бұдан соматотропин малдың басқа физиологиялық белгілеріне зиянды әсер бермеді.
Кейінгі кезде соматотропинді малдың (ірі қараның, қойдың және шошқаның) еттілігін жақсарту үшін де қолдануда. Малдың түріне, күтіміне және гормондық препараттың мөлшеріне байланысты тәжірибе тобының орта есеппен тәулігіне қосқан салмағы 20-30%-ке артты, бұл малды семірту уақытының қысқаруына әкелді. Бұдан басқа, өсу бірлігіне азық шығынының азайғаны байқалды. Ең бастысы, малдың тірі салмағының артуы еттілік сапасының нашарлауына әкелген жоқ: етте соматотропиннің артық мөлшері болған жоқ. Гормонның 30-200 мг-ын организмнің 1 кг массасына тәулік сайын енгізу торайдың өсуін тездетті және еттің сапасын жақсартты.
Еттегі май мөлшері 55%-ке азайды. Соматотропинді қолдану арқасында шошқалар 100 кг салмақты қосуы кәдімгі азықтандырумен салыстырғанда 7-10 күнге кеміді.
Қазірге кезде «Монсанто» компаниясы организмге ұзақ уақыт әсер ететін гормондық препараттарды алу жұмыстарын жүргізуде. Мұндай соматотропинді өндірістік жағдайда қолдану өте ыңғайлы (әдетте, гормонды малға күн сайын енгізу керек). Алайда, генетикалық инженерияға негізделген биотехнологиялық өнімдер сауда объектісіне айналғандықтан мұндай жаңа коммерциялық зерттеулердің технологиясын фирма әдетте құпияда ұстап, оның нәтижесін баспадан шығармайды.
Жаңа зерттеулер соматотропинді организмнің өсуіне әсер ететін басқа гормондармен қоса қолданылу мал өсуін тиімді жеделдететінін көрсетті. Осындай гормонның бірі соматомединнің рекомбинантты гені синтезделді. Оны соматотропинмен бірге қолдану ірі қара мен шошқаның өсуін өте тиімді жеделдетті (Т. Вагнер және т.б., 1986). АҚШ-тың «Биоген» фирмасы бұқаның соматомедин С генінің клонын көбейтіп, оның өнімін бактериялық клеткадан өндірді. Бұл фирманың зерттеушілері өздерінің ғылыми еңбектерін баспада түгел жарияламаса да, олардың пікірі бойынша соматомединнің мал өсуін жеделдеткіш препараты ретінде соматотропинмен салыстырғанда кейбір артықшылықтары бар.
Алдыңғы қатардағы биотехнологиялық фирмалар (мысалы, Дженерал Диагностик Корп, АҚШ) рекомбинантты ДНҢ технологиясы арқылы мал өсуін реттейтін белокты заттарды шығаруды бастады. Мысалы, протеаза ингибиторлары белоктың ыдырау жылдамдығын бәсеңдетуі арқылы малдың ет массасының көбеюіне себепші болады. Белоктық препарат - агонист май қыртыстарын азайтып, ет ұлпасының түзілуін күшейтеді.
12-дәрістің тақырыбы: Эмбриондарды реконструкциялаудың биотехнологиялық маңызы.
Эмбриондарды реконструкциялаудың биотехнологиясы. Мал эмбрионын трансплантациялау терең зерттеуді керек ететін бірқатар биотехнологиялық проблемаларды туғызды. Бұл пробломалар алынған эмбрионның генотипі мен фенотипін қайтадан құрастыру (реконструкциялау) арқылы биотехнологиялық процесті меңгеру мүмкіндігін зерттеуді алға қойды. Бұған монозиготалы егіздер, химерлі (немесе аллофенді) және трансгенді малдар алу жатады.
Мал эмбрионы клонын көбйту мүмкіндігі ғалымдарды бұрыннан қызықтырып келеді. Ағылшын эмбриологы Дж. Гердонның ядроларды тасымалдау әдісін (алдыңғы тарауды қара) ойлап шығарғаннан бастап, мал эмбрион клонын алу проблемасы жаңа деңгейге көтерілді. Эмбрион клонын алу эукариоттық клетканың тотипотенттілік қасиетіне тікелей байланысты. Мал шаруашылығында эмбрион клондарын алу мүмкіндігін Ф. Сиделдің қоянға жүргізген классикалық тәжірибелері көрсетті: жалғыз бластомерді екіге бөлу арқылы екі қоян алынды. Көптеген зерттеулер 2-8 клеткалық эмбрион бластомераларын бөлу арқылы дамуы қалыпты мал төлдерін алуға болатынын дәлелдеді (Н. Мур және т.б., 1968; С. Уиладсен және т.б., 1981; X. Нагасима және т.б., 1987; Т. Мак Эвой және т.б., 1987 т. б.).
Мал шаруашылығында 1979 ж. С. Уиладсен әлемде алғаш рет монозиготалы қозыларды алды. Суперовуляциядан өткен қойлардан 2 клеткалық эмбриондарды екі бөлікке бөлді, 16 монозиготалы бластомераларды алды. Оларды 16 реципиент қойларға тасымалдау нәтижесінде бірінен-бірі айнымайтын бес жұп егіз және бес жалғыз қозылар алынды. Екі жылдан кейін С. Уиладсен және С. Полж алғаш рет бұзаулардың эмбриондық клонын алды: 8-бластомер сатысындағы эмбриондарды бөлу нәтижесінде бір үш монозиготалы және екіден монозиготалы қос бұзаулар алынды. Кейін жүргізіліген зерттеулерде монозиготалы құлын және лақтар алынды.
Сонымен мал эмбрионын екіге және одан көп бөліктерге бөліп, бірнеше монозиготалы егіздер алуға болады. Мұндай егіздердің үлкен артықшылығы - олар бір-бірінен генотипі бойынша ешқандай айырмашылығы жоқ. Бұл әдістің биотехнологиялық маңызы өте зор, тіпті, қазірдің өзінде АБШ, Канада және Жапон елдерінде монозиготалы егіздер алу коммерциялық сипатқа ие болды.
Генетикалық химера алу. Болашақта биотехнология үшін генетикалық химераларды алудың маңызы өте зор. Генетикалық химера деп бернеше әр түрлі эмбриондарды біріктіру арқылы пайда болған организмдерді түсінеді. Барлық ата-аналық формалардың клеткалары бар генетикалық химералар аллофенді деп те аталады. Біз оны аллофенді тышқанды алу тәжірибесінде организм деңгейіндегі генетикалық инженерияның әдісі ретінде қарастырдық. Енді осындай малды мал шаруашылығында құрастыру мүмкіндігін қараймыз.
Химерлі малдарды алу үлгісі зертханалық жануар - аллофенді тышқан алу үлгісіне сәйкес өтеді. Оларды алудың екі әдісі белгілі: екі және одан көп бластоцист немесе морулаларды бір эмбрионға біріктіру (агрегациялық) және бір эмбрионның бластоцист ішіне басқа эмбрионның бластомераларын ендіру (иньекциялық) арқылы. Бірінші әдісті А. Тарковский (1961) және В. Минц (1962), ал екінші әдісті Р. Гарднер (1968) ұсынды.
Е. Такер және т.б. 1974 жылы төрт ата-аналық формалардан пайда болған эмбриондарды біріктіру арқылы химерлі қой алғанын баспада жариялады, 10 жыл өткен соң қой (2n-54) мен ешкінің (2n-60) клеткаларынан құралған генетикалық химералар алынды (С. Фехили және т.б., 1984). Қазіргі кезде әр түрлі сиыр тұқымдары эмбриондарын біріктіру арқылы химерлі бұзаулар (Г. Брем және т.б., 1985), ірі қара (Воs.taurus) мен зебу (Воs. іndісus) эмбриондарын біріктіріп, түраралық генетикалық химералар да алынды.
Мал шаруашылығында әзірше генетикалық химералар қолдану алған жоқ. Алайда, бірқатар ауруларға төзімді немесе сүтті және етті үйлескен генетикалық химерлі малдар алудың зоотехникалық және мал дәрігерлік маңызы бар.
Мал эмбриондарын реконструкциялау әдістері ішінен биотехнология үшін ең перспективалы әдісі — трансгенді малдар құрастыру.
Трансгенді жануарлар алу. Трансгенді жануарларды алу әдістері. Геномында бөтен ген (немесе гендер) бар жануарлар трансгенді (немесе трансформацияланған) деп аталады. Трансгенді жануарлар алу трансгеноз әдісі арқылы іске асады. Трансгеноз деп генді бір биологиялық жүйеден басқа жүйеге жаңа белгілері бар организмнің жаңа формасын алу үшін жасанды жолмен тасымалдауды түсінеді. Трансгенді жануарлар әр түрлі биологиялық активті биотехнологиялық заттарды синтездеу және бағалы белгілері (тұқымдылығы және өсу қарқындылығы жоғары, вирустық ауруларға төзімді т.б.) бар малдардың, жаңа тұқымдарын алу үшін қолданылуы мүмкін.
Трансгеноз. Трансгеноз әдісімен бөтен генді эукариоттық жыныс клеткаға енгізіп, оның жұмысын бақылау арқылы генетикалық инженерияның көптеген іргелі мәселелерін айқындауға болады, өйткені мұнда трансгенді эмбрионның жатырдағы даму ерекшеліктерін зерттеу мүмкін болады. Бұдан басқа ген жұмысы механизмдерінің түр ерекшелік дәрежесін айқындауға болады. Тасымалданған гендер (трансгендер) жаңа иесінің генетикалық аппаратымен құрылымды әрі функциялы байланысқандықтан бұл процесс in vitro жағдайындағы генетикалық рекомбинацияға әкеледі, ал бөтен гендерді, тасымалдау тәсілдері клетка және организмдердің генетикалық инженериясының әдістері болып саналады. Басқа жағынан, трансгенді жануарларды алу бойынша жүргізілген ғылыми іргелі зерттеулер мен олардың нәтижелерінің іс жүзінде қолданылуы арасындағы алшақтық соншалықты емес, демек, осы бағыттағы зертханалық жұмыстарды тек таза теориялық деп қарауға болмайды.
Трансгенді жануарларды алу үшін рекомбинатты гендерді микротүтікше және микрокапиллярлар көмегімен ұрықтанған ооциттің (жұмыртқа клетканың) пронуклеусіне енгізу әдісі кең қолданылады. Трансгеноз әдісі арқылы трансгенді тышқандар алу жақсы зерттелген. Мұның басты себебі болып тышқан ооциттері цитоплазмасының мөлдір болуы саналады. Басқа жануарлардың, соның ішінде малдың ооциттері мөлдір емес, сондықтан рекомбинантты ДНҚ-ны пронуклеуске енгізу өте күрделі және қиын іс. Осыған қарамай, соңғы кезде әр түрлі әдістемелік және техникалық жетілдірулер арқасында трансгенді қой, сиыр, шошқа және қоян алу іске асты (Хаммер және т.б., 1985; Крамер және т.б., 1986; Чёч, 1987).
Трансгеноз жұмысы көп жақты және бірнеше сатылардан тұрады. Алдымен, екі пронуклеус (аталық және аналық) сатысындағы зиготаларды алу керек. Бұл үшін синхронды овуляция, уақтылы қолдан ұрықтау немесе шағылыстыру керек, осыдан кейін белгілі уақыт өткеннен кейін зиготаларды хирургиялық жолмен алуға болады. Алынған зиготаларға бөтен ДНҚ-ны енгізбестен бұрын, оны іn vitro жағдайында әр түрлі әдістер мен тәсілдер арқылы сақтау керек. Енгізу кезінде зиготалар вазелин майының астындағы арнайы ерітіндінің тамшысына орналасады, бұл сұйықтықтың кеуіп кетуінен сақтайды. ДНҚ-ны зиготаға енгізу үшін диаметрі 0,5-2 мкм аралығындағы шыныдан дайындалған микротүтікшелер қолданылады.
Микротүтікшенің кемегімен 0,5 секундтан 2 минут аралығында ең аз дегенде 10-11 мл ДНҚ-ны зиготаға микроскоптан бақылап енгізеді. Микроинъекциялау процесі зиготалар үшін зақымды, сондықтан олардың біраз мөлшері жойылып кетеді. Микроинъекциядан кейін 2 сағатқа жетпей жарамды зиготаларды (трансгенді) алдынн ала, арнайы дайындалған аналық — реципиенттерге тасымалдайды. Бұл кезеңде де зиготалардың көп мөлшері зақымданады. Аяғында, трансгенді жануарлардың шығуы 1%-ке тең болады. Алайда, мұның өзі трансформация және трансдукциямен салыстырғанда өте жоғары көрсеткіш болып саналады. Қазіргі кезде трансгеноз әдісі көптеген ғылыми зерттеулерде қолдану алды.
Трансгенді тышқан алу тәжірибес. Р.Пальмитер тәжірибесі. 1980 ж. Ф. Раддел және оның қызметтестері алғаш рет герпес вирусының тимидинкиназа генін тышқан клеткасының геномына енгізе алды. Трансгеноз нәтижесінде алынған жеті тышқанның төртеуі ТК гені бойынша трансгенді болып шықты.
Трансгенді тышқандарды алу бойынша кейін жүргізілген көптеген зерттеулер оның тиімділігі әр түрлі факторларға байланысты екендігін дәлелдейді. Рекомбинантты генді аталық пронуклеуске енгізу процесінде трансгенді жануарлар жиі шығатыны белгілі болды. (Р. Бринстер және т.б., 1985, К. Гордон, Ф. Раддел, 1984). Бұдан басқа олардың пайда болу жиілігі ДНҚ-ның үшінші құрылымына және оның мөлшеріне (түзу формалы ДНҚ-ның көп мөлшерін қолданғанда трансформация дәрежесі жоғарылайды) байланысты Р. Пальмитер және т.б., 1984; Т. Вагнер және т.б., 1986.
Бөтен геннің иесінің ДНҚ-сымен байланысу сипатын зерттеу үлкен проблема болып саналады. Трансгеннің клетка ДНҚ-сымен байланысатын белгілі орыны болуы керек, алайда, көптеген зерттеулер оның хромосоманың әр түрлі бөліктерімен байланысатынын дәлелдейді. Бұл процестің механизмі әзірше толық түсінікті емес. Дегенмен осыған орай трансген экспрессиясының әр қилы өтуі бұл проблеманы терең зерттеуді қажет етеді. Трансгеннің иесінің геномымен байланысуы кездейсоқ жүретін болса, онда ол хромосоманың гетерохроматинді бөліктеріне еніп, инактивацияланып кетеді. Бұдан бөлек хромосома бөлігімен байланысқан трансгеннің активтілігі клеткалық ДНҚ-ның реттеуші элементтері-промотор, энхансер және силансерлерге байланысты болуы да мүмкін.
Микроинъекциялау арқылы трансгенді тышқан алу. Трансгенді жануарларды алудың қолданбалы зерттеулерінің бағыттары үшін егеуқұйрықтың соматотропип генін тышқанның геномына енгізу Р. Пальмитер (1982) тәжірибесінің маңызы өте зор. Егеуқүйрықтың соматотропин генінің клондарын ген инженериясы әдісі көмегімен бактерия клеткасынан алуға болады. Алайда, мұндай генді тышқан клеткасына енгізу үшін оның бактериялық промоторын эукариоттық реттеуіш элементтерімен ауыстыру қажет. Осы мақсатпен Р. Пальмитер тышқанның ДНҚ- сынан металтионеин генінің промотор бөлігін бөліп алды. Бұл геннің синтезі іn vivo жағдайында ауыр металдардың иондары (Zn, Сd) арқылы қозады. Микроинъекциялау үшін егеуқұйрықтың өсу гормонының құрылымды генінен және металтионеин промоторынан құрастырылған рекомбинантты ДНҚ қолданылды. Зерттеуші лер осындай рекомбинантты ДНҚ-ның 600 көшірмесін әрбір зиготаның аталық пронуклеусіне енгізді. Нәтижесінде 21 ұрпақ алынды, оның 7-інде егеуқұйрықтың гені байқалды. Трансгенді тышқандардың азығына мырыш тұзын —ZnSО4 қосқанда, олардың геномындағы бөтен геннің функциясы іске асты. Мұндай тышқандардың қанын талдау оларда өсу гормонының мөлшері қалыпты жағдайдағыдан 100-800 өсе жоғары екендігін көрсетті. Гормон мөлшерінің жоғарылауы ген көшірмелері санының артуына байланысты болды. Гормонның артық мөлшерінің синтезделуі тышқан салмағының 1,8 есе артуына әкелді. Мұндай трансгенді жануарды алып тышқан деп атайды. Кейін жүргізілген зерттеулер Р. Пальмитер тәжірибесінің нәтижесін әр қилы деңгейлерде дәлелдеді. Неміс ғалымы Г. Брэм (1986) тәжірибесінде алынған трансгенді тышқандардың салмағы бақылау тобындағы тышқандардан 1,51-2,36 есе ауыр екендігін көрсетті. Бірқатар зерттеулер (Е. Вагнер және т.б., 1985; Р., Бринстер, 1985; А. Дыбман, С. Гордецкий, 1987 т. б.) адамның соматотропин т. б. гормондар генін тышқандарға енгізіп, трансгенді ұрпақ алу мүмкіндігін дәлелдеді.
Трансгенді тышқан алу тәжірибелерінің нәтижелері осындай зерттеулердің мал шаруашылығында жаңа биотехнологиялық бағыттарды жетілдіру үшін үлкен болашағы бар екендігін көрсетеді. Шотландия генетиктері Дж. Кларк және т.б. француз биологтарымен бірігіп, қой сүтінің — лактоглобулин белогы генін микроинъекциялау арқылы трансгенді тышқандар ала алды. Мұндай тышқандардың сүт бездерінде жаңа белоктың синтезделуі өтіп, сүттің сапасы өзгерді. АҚШ-та жануарлар биотехнологиясы саласының белгілі маманы Катерина Гордон сүт бездерінде бағалы медициналық препарат — адамның плазминоген белогы синтезделетін трансгенді тышқандар алды. Қазіргі кезде трансгенді тышқандар зертханада іргелі ғылыми зерттеулерге үлкен үлес қосуда. Алайда, оларды биотехнологиялық өнімдер өндіру мақсаты үшін қолданудың белгілі қиындықтары бар. Сондықтан 1985 жылдан бастап, трансгенді мал алуда көптеген ғылыми жұмыстар жүруде.
Трансгенді малдарды алу зерттеулерінде тышқандардың трансгеноз әдісінің үлгісі икемделіп, қолдану алды. Жалпы трансгенді малдарды алу бірінің артынан бірі өтетін мынадай кезеңдерден тұрады: 1) рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру және оның клонын алу; 2) трансгенозаға жарамды зиготалар алу және олардың пронуклеустерін айқындау; 3) рекомбинантты ДНҚ көшірмелерінің белгілі мөлшерін зиготалар пронуклеустеріне (мүмкіндігінше аталық) микротүтікше арқылы енгізу; 4) зиготаларды гормондық дайындықтан өткен аналықтардың жыныс жолдарына тасымалдау; 5) туылған малдардың генотип және фенотипі бойынша бағалап, трансгенді екендігін анықтау бөтен геннің клетка ДҢҚ-сымен байланысуын, рекомбинантты ДНҚ-ның экспрессиясын, ген өнімінің синтезделуін анықтау; 6) трансгенді малдардың жаңа қасиетінің ұрпаққа тұқым қуалайтын бақылау.
Зертханадағы жануарларға қарағанда малдар зиготасының пронуклеустерін микроскоптан көру өте қиын, өйткені ұрықтанған малдың аналық жыныс клеткасында әр түрлі майлар мен пигменттердің болуы зиготаны көмескі етеді. Сондықтан генді микротүтікшемен тікелей пронуклеуске енгізу қиындық туғызады. Бұл қиындық трансгенді малдар алу жиілігіне үлкен әсер өтеді, өйткені пронуклеуске микроинъекциялау арқылы ғана барлық ұрпақтың 20-30%-тін трансгенді ете алады. Қазіргі кезде бұл қиындықты болдырмайтын бірнеше тәсілдер зерттелуде (Д. Крамер және т.б., 1986). Осы бағытта контрасты микроскоп, центрифуга немесе флуоресценттік бояуларды қолдану пронуклеустерді айқындау үшін үлкен көмегін тигізді.
Трансгенді жануарлар алудың маңызы. Трансгенді малдарды алу кезеңдері. Трансгеноз әдісі ауыл шаруашылық малдары ішінен алдымен қойда айтарлықтай ғылыми нәтиже берді. Австралия ғалымдары зиготаға өсу гормоны генін микроинъекциялау арқылы әлемде алғаш рет трансгенді қойлар алды (Т. Скотт, 1986). Зерттеушілер тәжірибеде тышқанның металтионеин промоторын қойдың өсу гормонының құрылымды генімен біріктірді. Бес аптадан кейін трансгенді қозыларға мырыштың болмашы мөлшерін енгізгенде рекомбинантты ДНҚ тізбегінің реттеуші бөлігі, яғни промоторы активтеліп, соматотропин генінің интенсивті синтезі іске асты. Осының нәтижесінде 2-4 жылдан кейін трансгенді қойлар өздерінің тірі салмағы бойынша құрдастарынан 1,5 есе асып түсті. Қазіргі уақытта Австралия ғалымдары құрамында күкірт бар амин қышқылдарының синтезделуіне жауапты екі ферментті коделейтін жаңа гендерді қойларға енгізу жұмысын жүргізуде.
Бишоф бастаған зерттеушілер тобы адам қанының ұю факторын трансгенді қойлардың сүтінен алу проектісін , іске асыру үшін қызу ғылыми жұмыстар жүргізуде. Олар қой геномына қан ұюының IX факторының генін қойдың — лактоглобулин промоторымен біріктіріп, енгізу мақсатын алға қойды. Ұю факторы қойдың сүт бездерінде синтезделіп, сүтке бөлінеді деп күтілуде. Зерттеу жұмысының бас кезінде қойдың лактоглобулин белогы тышқанның сүт бездерінде синтезделіп, сүтке бөлінді. Келесі эксперименттерде Дж. Симонс және т.б. — лактоглобулин генінің бірінші экзонының аймағына адам қаны ұюының IX факторының генін жалғап, рекомбинантты ДНҚ құрастырды. Осы конструкцияны зиготаларға микроинъекциялау арқылы трансгенді қойлар алынды. Рестрикциялық талдаудың мәліметтері бойынша трансген толық бағалы болғанымен, ол өз функциясын іске асырмады. Казіргі кезде зерттеушілер оның себебін анықтап, алга қойған мақсаттарын жақын арада шешеді деп күтілуде. Шотландия генетиктері сүтінде адамның антитрипсин а— 1 белогы бар трансгенді қойларды алды. Бұл қосылыстың 1 л. сүттегі мөлшері 35 г. тең болды. Медицинада оны өкпе ауруларын емдеу үшін қолданады. АҚШ ғалымдары трансгенді ешкілердің 1 л сүтінен адам қанының тромбларын ыдырататын плазминогеннің 3 г ала алды (Р. Селтзер,1992).
Болашақтағы ғылыми жобаларда қойдың, сиырдың немесе ешкі мен мегежіннің сүт бездерінен (немесе қанынан) интерферон, инсулин сияқты өте құнды дәрі-дәрмек алу жолдарын ойластыруда. Бұл мәселелер тышқандарда белгілі деңгейде шешімін табуда.