12 Диссертация Смолянова

121

обработку результатов иммуноферментного анализа проводили с помощью программы

«Паралайн», разработанной в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича. По рисунку 5.5 можно судить о

параллельности и линейности кривой разработанного СОП-1 по отношению к 3 сериям ЛП ИГЧ

против COVID-19. Статистические данные, полученные при этом, отражены в таблице 5.12.

В результате было установлено, что зависимости логарифмов оптических плотностей от

логарифма кратности разведения для исследуемых ЛП и СОП-1 линейны и эти линии

параллельны друг другу, что соответствует критерию приемлемости.

Таблица 5.12 - Изучение параллелизма при количественном определении антител к SARS-CoV- 2 с СОП-1 и в лекарственном препарате иммуноглобулина человека против COVID-19 с использованием набора реагентов ИФА ЕИ

В результате проверки установлено, что основное условие выполнено и для любого испытуемого образца ЛП ИГЧ против COVID-19 в пробе с использованием набора реагентов ИФА ЕИ прямая линия параллельна линии для СОП-1.

Все наблюдаемые серии тест-системы для количественного определения антител к SARS- CoV-2 с использованием набора реагентов ИФА ЕИ имеют значение коэффициента корреляции не ниже 0,990. Коэффициент угла наклона близок к единице. Отклонение от линейности для различных серий не превышает 0,04.

Определение прецизионности

Данная методика количественного определения антител к SARS-CoV-2 (показатель специфической активности) в ЛП ИГЧ против COVID-19 является оригинальной, при разработке оригинальной методики определяли повторяемость (сходимость) результатов, получаемых с ее использованием, и дополнительно определяли внутрилабораторную (промежуточную)

прецизионность.

Повторяемость (сходимость)

Повторяемость методики количественного определения антител к SARS-CoV-2

(показатель специфической активности) в ЛП ИГЧ против COVID-19 с использованием тест-

123

Определение внутрилабораторной прецизионности:

Далее были проведены исследования по анализу внутрилабораторной прецизионности,

которую оценивали по результатам постановки 6 однородных образцов в четырех повторностях,

далее рассчитывали объединенное стандартное отклонение (S.D.) и объединенное относительное

стандартное отклонение (RSD).

Проведенные исследования внутрилабораторной прецизионности, позволили сделать вывод о том, что объединенное относительное стандартное отклонение внутрилабораторной прецизионности составило не более 14,6% (Табл. 5.15), что удовлетворяет критерию приемлемости – не более 20 %.

Таблица 5.15 - Изучение внутрилабораторной прецизионности результатов определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина против COVID-19 с использованием набора реагентов ИФА ЕИ (2 оператора, 2 дня)

Определение аналитической области:

При определении аналитической области методики (интервала между верхним и нижним значением аналитических характеристик определяемого компонента в объекте анализа)

критерием приемлемости служили приемлемый уровень правильности и внутрилабораторной

(промежуточной) прецизионности.

К величине аналитической области методик предъявляются следующие требования:

методики количественного определения должны быть применимы в интервале от 80 до 120 % от номинального значения определяемой аналитической характеристики. Соответственно при

124

определении аналитической области методики использовали значения по диапазону

экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной модели, от 0,006 до 0,25 АКЕ/мл (Табл.

5.16-5.18).

Таблица 5.16 - Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина против COVID-19 при определении аналитической области с использованием набора реагентов ИФА ЕИ

(1 оператор, 1 день)

Таблица 5.17 - Изучение сходимости результатов определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина против COVID-19 при определении аналитической области с использованием набора реагентов ИФА ЕИ

(2 оператор, 2 день)

Полученные результаты расчета относительного стандартного отклонения на верхнем и нижнем пределах обнаружения составили не более 8,8% и 11,8%, соответственно, что удовлетворяет критерию приемлемости – не должен превышать 25 %.

Относительное стандартное отклонение на верхних и нижних пределах (близко к LLOQ и

ULOQ) аналитической области, которая находится в пределах 0,25 – 0,006 АКЕ/мл, при определении правильности и внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности составило не более 18,3%, что соответствует критериям приемлемости не более 25 % (Табл. 5.18).

125

Таблица 5.18 - Изучение внутрилабораторной прецизионности результатов определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в лекарственном препарате иммуноглобулина против COVID-19 при определении аналитической области с использованием набора реагентов ИФА ЕИ (2 оператора, 2 дня)

Относительное стандартное отклонение на верхних и нижних пределах (близко к LLOQ и

ULOQ) аналитической области, которая находится в пределах 0,25 – 0,006 АКЕ/мл, при определении правильности и внутрилабораторной прецизионности составило не более 18,3%,

что соответствует критериям приемлемости - не более 25 % (Табл. 5.18).

Таким образом, валидация метода иммуноферментного анализа (ИФА) при проведении испытания по показателю «Специфическая активность» проведена на примере примере трех последовательных серий ЛП ИГЧ против COVID-19 с использованием набора реагентов ИФА ЕИ. Специфическая активность препарата составила не менее 160 АКЕ/мл, RSD при определении сходимости и точности - не более 20 %, коэффициент вариации при определении линейности – не менее 0,99. Аналитическая область находится в пределах 0,4 – 0,006 АКЕ/мл, RSD при определении сходимости и точности образцов с высоким и низким содержанием специфических антител (близко к LLOQ и ULOQ) - не более 25 %. Результаты, полученные двумя исполнителями,

были сопоставимы и соответствовали критериям приемлемости.

Анализ результатов валидационных параметров тест-систем ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ для использования в методике определения концентрации антител к SARS-СоV-2 в ЛП ИГЧ против

COVID-19 позволил сделать заключение о том, что они могут быть применимы при количественном определении антител к SARS-СоV-2.

126

5.3. Гармонизация значения специфической активности СОП-1, выраженного в АКЕ/мл, со значениями референс-панели ВОЗ NIBSC 20/268, охарактеризованной в единицах связывания BAU/мл

На следующем этапе работ была проведена аттестация разработанного стандартного

образца СОП-1 относительно референс-панели NIBSC 20/268, охарактеризованной в принятых

ВОЗ единицах связывания BAU (binding antibody units), с использованием наборов реагентов

ИФА ГНЦ (48 проб), ИФА ЕИ (48 проб) - работы проводились двумя операторами в течение двух

дней в двух повторностях. Результаты представлены в таблицах 5.19-5.21.

Таблица 5.19 - Оценка аттестованного значения специфической активности и определение коэффициента пересчета антиковидных единиц (АКЕ/мл) в международные единицы связывания (BAU/мл) разработанного СОП-1 с использованием тест-системы ИФА ГНЦ.

127

Таблица 5.20 - Оценка аттестованного значения специфической активности и определение коэффициента пересчета антиковидных единиц (АКЕ/мл) в международные единицы связывания (BAU/мл) разработанного СОП-1 с использованием тест-системы ИФА ЕИ

Таблица 5.21 - Оценка аттестованного значения содержания антител к SARS-CoV-2 в СОП-1 и характеристики неопределенности аттестованного значения в международных единицах связывания (BAU/мл)

128

По результатам статической обработки специфическая активность разработанного СОП-

1 была принята за 2234,8±158,8 BAU/мл. Однако следует учесть, что международную референс-

панель NIBSC 20/268 предлагается использовать для оценки и разработки тест-систем для обнаружения и количественного определения антител против SARS-CoV-2, панель состоит из 5

пулов плазмы (смесь 10 индивидуальных образцов), охарактеризованных в международных единицах (МЕ/мл) и единицах связывания BAU (binding antibody units).

Коэффициент пересчета

На следующем этапе работ была проведена оценка соотношения антиковидных единиц

(АКЕ) и единиц связывания (BAU). Для этого 48 серий препарата КОВИД-глобулин, были протестированы относительно международной панели NIBSC 20/268, охарактеризованной в единицах связывания BAU/мл, и СОП-1, аттестованного в АКЕ/мл, с использованием метода ИФА (наборы реагентов ИФА ГНЦ, ИФА ЕИ). Полученные результаты представлены в таблицах

5.22-5.24.

Таким образом, коэффициент пересчета антиковидных единиц (АКЕ/мл) в

международные единицы связывания (BAU/мл) составил 6,4 для набора реагентов ИФА ГНЦ, 7,0 для набора реагентов ИФА ЕИ.

Однако следует учесть, что международную референс-панель NIBSC 20/268 предлагается использовать для оценки и разработки тест-систем для обнаружения и количественного определения антител к SARS-CoV-2, панель состоит из 5 пулов плазмы (смесь 10

индивидуальных образцов), охарактеризованных в международных единицах (МЕ/мл) и

единицах связывания BAU/мл (binding antibody units), и ее использование для оценки уровня антител к SARS-CoV-2 в препаратах иммуноглобулинов не изучалось.

129

Таблица 5.22 - Определение специфической активности в образцах лекарственного препарата иммуноглобулина человека против COVID-19 с использованием ИФА ГНЦ