8542
.pdfМинистерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования
«Нижегородский государственный архитектурно-строительный университет»
Афанасьева И.М.
Биология
Учебно-методическое пособие по подготовке к лабораторным работам для обучающихся по
дисциплине «Биология», направлению подготовки 05.03.06 – Экология и природопользование, профиль Природопользование
Нижний Новгород ННГАСУ
2016
2
УДК 574
Афанасьева И.М./ Биология [Электронный ресурс]: учеб.-метод. пос. / Афанасьева И.М. ; Нижегородский гос. архитектур. - строит. ун - т – Н. Новгород: ННГАСУ, с 92. 2016. – 1 электрон. опт. диск (CD-RW)
В методических указаниях приведены лабораторные работы по курсу «Биология». Также рассматриваются закономерности биологических систем по уровням организации живой материи. Раскрыты сложные механизмы происхождения развития органического мира, изложены новейшие достижения генетики и молекулярной биологии.
©Афанасьева И.М., 2016
©ННГАСУ, 2016
3
СОДЕРЖАНИЕ
Лабораторная работа №1. |
Принцип работы светового микроскопа…5 |
|
Лабораторная работа №2. |
Подготовка материалов для |
|
цитогенетических исследований………………………………………… |
11 |
|
Лабораторная работа №3. |
Приготовление препаратов………… |
.....…16 |
Лабораторная работа №4.Микроскопическое изучение кариотипов животных и растительных клеток………………………………………..19
Лабораторная работа №5. Анафазный метод учета перестроек хромосом …………………………………………………………………..24
Лабораторная работа №6. Методы учета индуцированных микроядер
в животных и растительных клетках (микроядерный тест)……… |
……28 |
Лабораторная работа №7. Метафазный анализ перестроек хромосом у
растений, на примере Crepis capillaris (Скерда)……………………… |
|
…32 |
Лабораторная работа № 8. Определение процентного содержания |
|
|
полового хроматина в слизистой оболочке рта…………… |
…………… |
36 |
Лабораторная работа № 9. Изучение гигантских хромосом в слюнных железах личинки хирономуса………………………… ……… ………….40
Лабораторная работа № 10.Биологический контроль водоема методом
сапробности…………………………………………………………… |
…..42 |
Лабораторная работа №11.Биологический анализ активного ила…...51
Лабораторная работа № 12.Определение качества воды в пресноводном водоеме по видовому разнообразию зообентоса….........64
Лабораторная работа № 13. Биотестирование водоемов по уровню |
|
белков – металлотионеинов в мягких тканях двустворчатых |
|
моллюсков………………………………………………………………… |
69 |
4
Лабораторная работа №14. Оценка потенциальной опасности |
|
химических веществ по их способности снижать фильтрационную |
|
активность гидробионтов………………………………………………… |
73 |
Лабораторная работа № 15. Оценка токсичности воды по |
|
фильтрационной активности дафний, регистрируемой с помощью |
|
флуоресценции хлорофилла микроводорослей………………………… |
76 |
Лабораторная работа № 16. Определение концентрации белка в |
|
биологических жидкостях гидробионтов в ответ на изменение среды |
|
обитания…………………………………………………………………… |
80 |
Лабораторная работа № 17. Определение концентрации лизоцима в |
|
биологических жидкостях гидробионтов в ответ на изменение среды |
|
обитания…………………………………………………………………… |
84 |
Список литературы……………………… |
.……………………………..88 |
5
Лабораторная работа №1
Тема. Принципы работы светового микроскопа. Клеточный / митотический / цикл.
Цель работы. Ознакомиться с устройством и принципами действия светового микроскопа при помощи определения митотического индекса.
Задачи. 1. Ознакомиться с устройством и принципами действия светового микроскопа.
2.Закрепить знания о принципах действия микроскопа путем подсчета числа клеток в зоне деления корешка на примере лука; подсчет клеток производить на разных фазах митотического цикла.
3.Определить митотический индекс, используя временные и. постоянные препараты корешка лука; полученные результаты сравнить.
4.Данные занести в таблицу.
5.Сделать выводы.
Материалы и оборудование:
-микроскопы,
-настольные лампы,
-временные и постоянные препараты корешков лука. Теоретическая часть. Устройство и технические характеристики
светового микроскопа.
Основная часть микроскопа - это оптический узел, который состоит из осветительной системы / зеркало и конденсор /, объективов и окуляров вместе с тубусом. Все части оптического узла строго центрированы.
Конденсор с ирисовой диафрагмой расположены под столиком микроскопа. Различают несколько типов конденсоров в зависимости от метода наблюдения: конденсор светлого поля, конденсор темного поля, конденсор для наблюдения по методу фазового контраста. Два последних используются для наблюдения за живыми объектами.
Зеркало имеет две поверхности: выпуклую и вогнутую. Вогнутая - для рассеянного света, плоская - для лампы. Зеркало и конденсор предназначены для освещения препарата пучком света, который за тем попадает в объектив, находящейся в гнезде револьвера.
Объектив - это многолинзовая система, наиболее важная составная часть узла микроскопа.
Недостатки / аберрации / объективов:
6
-хроматическая аберрация вызывается тем, что фиолетовая часть спектра преломляется сильнее, чем красная, поэтому изображение, созданное лучами одной длины волны, не совпадает с изображением розданным лучами с другой длиной волны, например, красная с синим, в результате изображение получается окрашенным;
-сферическая аберрация возникает благодаря тому, что лучи, проходя рез разные участки линзы, преломляются различно и не собираются в ну точку; эта аберрация делает изображение нерезким;
-кривизна поля; при этом нельзя одновременно резко видеть структуры в центре и на краях поля зрения.
Эти недостатки могут быть исправлены в объективах ахроматах, апохроматах, планохроматах и планопохроматах. У ахроматов исправлена хроматическая аберрация для двух длин волн: красного и фиолетового цветов. У апохроматов исправлена аберрация для трех длин волн и гораздо лучше качество изображения. У планохроматов исправлена кривизна поля, планопохроматов - сферическая аберрация. Эти объективы на оправе имеют обозначения “ апохр” и так далее.
Существует несколько видов микроскопов, например, МБИ - 3 /микроскоп биологический исследовательский/, МБИ-6 и другие.
Планохроматы и планопохроматы имеют плоское поле зрения и употребляются при фотосъемке.
Назначение объектива:
1.В построении изображения участвует объектив, окуляр же только растягивает изображение.
2.Объектив строит геометрически подобное объекту увеличенное изображение с обратным расположением Частей по отношению к препарату
3.Одновременно объектив разрешает структуру, т.е. выявляет подробности, недоступные глазу человека.
Каждый объектив характеризуется тремя характеристиками: 1.Определенная разрешающая способн ость .
2.Увеличение
3.Фокусное расстояние.
Разрешающая способность объекта - это величина наименьшего диаметра видимых частиц или это наименьшее расстояние между двумя линиями, которые реально можно видеть в микроскоп. Она зависит от числовой апертуры объектива и длины волны света, применяемого для освещения объекта.
d =
7
где d - разрешающая способность объектива,
Л - длина волны света применяемого для освещения объекта, N/А - числовая апертура объектива.
При косом освещении объекта разрешающая способность увеличивается вдвое:
d =
Числовая или нумерическая апертура объектива /NA/ характеризует светособирательную способность объектива и определяется по формуле:
NA = n* sinα,
где NA - нумерическая апертура объектива ,
n - показатель преломления среды между фронтальной линзой объектива и покровным стеклом , α - половина апертурного угла конуса лучей, выходящего из точки
объекта и ограниченного входящим зрачком объектива.
Чем больше значение нумерической апертуры , тем лучше разрешающая способность объектива .Иммерсионные объективы имеют более высокую нумерическую апертуру , чем сухие , т.к. показатель преломления жидкости больше , чем воздуха .Так показатель преломления воздуха равен 1 , кедровое масло имеет п = 1,515; а вода имеет п=1,33. Наиболее высокая нумерическая апертура у масляно ~ иммерсионных объективов : от 1,25 до 1А.
Пример: Имеются два объектива увеличения х90 со следующими нумерическими апертурами : 1,3 и 1,25 и длиной волны 550.У какого из объективов разрешающая способность больше ?
Упервого объектива d=550/l , 30=0,423 /микрон/.
Увторого объектива d=550/l , 25=0,440/микрон/.
Следовательно , разрешающая способность у первого объектива больше .
Значение нумерической апертуры постоянно для объектива и указано на его оправе . Масляно - иммерсионные объективы имеют и буквенные обозначения: МИ, МО и другие и опоясаны темной полоской . Белой полоской опоясаны водная иммерсия.
На объективе указано также увеличение х8 , х40 , х90 .
Окуляр строит мнимое изображение .увеличивает его , не выявляя новых подробностей, строения .Существуют окуляры Гюйгенса ,
8
предназначенные для работ с ахроматами малых и средних увеличений и планрхроматами малых увеличений . При работе с апохроматами. , планохроматами , ахроматами больших увеличений используются
компенсационные |
окуляры , |
имеющие |
на |
оправе отметку |
“ К” или |
“ КОМП” . Есть |
окуляры |
Гомали |
, |
исправляющие |
кривизну |
изображения . Они используются только в
• тографии в видимой области спектра и применяются с объективами анохроматали.
Наибольшее полезное увеличение , получаемое в микроскопе не должно превышать 1000 NA .
1ример. Объектив х90 , NA =1,250. Какое должно быть максимально лезное увеличение ? Ответ: не более 1250 .
Разделив данное увеличение на 90 , получаем увеличение для окуляра не лее 13,8 , т.е. 10 или 12 .Если использовать большее увеличение окуляра, изображение будет ухудшаться .
Полное увеличение микроскопа - окуляр + объектив + бинокулярная
.садка.
Окуляры и объективы ввинченные в револьверное устройство крепятся на бусе . Обычно работают с наклонным тубусом , но для микрофотографирования применяется прямой тубус .
Увеличение бинокулярной насадки х1,5 . Бинокулярная насадка снабжена диоптрийным устройством . При этом оба поля зрения от двух тубусов насадки должны слиться в одну точку .
Движение препарата на столике микроскопа обеспечивается в двух взаимно перпендикулярных направлениях препаратоводителем . Столик и препаратоводитель снабжены нониусами .
Осветитель состоит из корпуса с патроном для лампы - точечного источника света , трансформатора с реостатом .
Для повышения контрастности исследуемого препарата следует вменять светофильтры дополнительного цвета к окраске изучаемой структуры , которая вследствии этого выглядит черной .Например , для красных структур нужен зеленый фильтр , для синих ~ желтый .
Апертура — это действующее отверстие оптической системы линз или лафрагмы . Для рациональной установки освещения для полного пользования освещения должны совпадать апертура осветителя , объектива и конденсора .
Клеточный митотический цикл .
Под митотическим циклом понимают совокупность взаимосвязанных и хронологически детермированных событий ,
9
происходящих в клетке в период к подготовке к делению а , также на протяжении самого митоза .
В настоящее время предложено разбивать митотический цикл на четыре периода:
1.Собственно митоз/профаза , метофаза , анафаза делофаза/. 2.Пресинтетический период /Y1/.
3.Период синтеза ДНК/8/.
4.Постсинтетический период/Y2/.
Три последние периода представляют собой интерфазу . Интерфаза . Ядро в клетке округлое с четкими границами . В нем
видны одно или два ядрышка . Хроматин в виде глыбок заполняет кариоплазму .
Профаза. Ядро в клетке увеличивается, в нём исчезают ядрышки. В кариоплазме наблюдается как бы клубок составленный из тонких нитей. Это хромосомы. В конце профазы оболочка ядра разрушается и хромосомы выходят в цитоплазму.
Метафаза. Хромосомы заметно укорачиваются, приобретая вид сильно изогнутых палочковидных структур. Постарайтесь найти клетку, в которой хромосомы лежат в экваториальной плоскости, образуя звезду.
Анафаза. Сестринскины хромосомы перемещаются к полюсам - поэтому в клетке можно увидеть фигуры, напоминающие две звезды. Обратите внимание, что хромосомы имеют вид шпильки. Центромеры направлены к полюсам, а плечи расходятся под углом друг к другу.
Телофаза. У противоположных полюсов, клетки видны рыхлые клубки из частично деспирализованных хромосом. В центре клетки начинает формироваться перегородка, которая постепенно делит материнскую клетку на две дочерниных.
Зарисуйте клетки на различных стадиях митоза и в интерфазе. На рисунке должны быть обозначены: - интерфаза /ядро, цитоплазма, хроматин/;
- профаза/хромосомы/'; -метафаза /материнская звезда/; -анафаза /дочерние звезды/; -телофаза/ядра дочерних звезд/.
Часто при эколого-цитологических работах необходимо учитывать уровень митотической активности исследуемой ткани. Чтобы вычислить уровень митотической активности ткани вычисляют соотношение числа клеток, находящихся в митозе к общему числу
10
клеток исследуемой ткани, т.е. определяют митотический индекс /М1/. Выражается митотический индекс в промиллях тысячных долях целого.
На основании подсчета количество клеток, находящихся в каждой стадии митоза определяется относительная длительность профазы, метафазы и анафазы, телофазы в процентах к общему количеству делящихся клеток.
Подсчет клеток на разных фазах митотического цикла приводят в нескольких полях зрения. Во избежание попадания на одно и тоже поле, препарат передвигается последовательно через одно поле зрения к другому вначале сверху вниз до конца препарата, затем через одно поле в сторону снизу вверх.
Митотический индекс определяется на основе просмотра 1000 клеток. Данные по подсчету заносятся в таблицу, включающую все стадии, и затем суммируются.
Митотический индекс определяется по формуле:
М1/П + М»А+.Т/»10РО *
1 '1 ~ общее количество просмотрена клеток 7
где MI-митотический индекс,
ГГ, М, А, Т- количество клеток, находящихся соответственно в профазе, метафазе, анафазе, телофазе;
1000 - переводной коэффициент.
Определение относительной длительности митоза определяется по формуле:
П _ П * |
юо |
дня профазы Г | - fiTJ^+ATr' * ^ |
|
для метафазы М |
у % и так. долее ' |
9 1 П*-М-нД + ТУ
где П, М, А, Т - число клеток в стадии соответственно в профазы, метофааы, анафазы, телофазы;
100<«— переводной коэффициент.
Ход работы.
1 .Ознакомьтесь на практике со световым микроскопом, его устройством и принципами действия.