ОБЩИЕ ФАРМАКОПЕЙНЫЕ СТАТЬИ

МЕТОДЫ АНАЛИЗА

ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

1. ХРОМАТОГРАФИЯ (ОФС 42-0092-09)

Хроматографией называется физико-химический метод разделения смесей, в котором разделяемые компоненты распределены между двумя ф а-

зами. Одна из этих фаз (стационарная фаза) неподвижна, а другая (подвиж-

ная фаза) постоянно движется в определенном направлении .

По свойствам подвижной и неподвижной фаз хроматографические ме-

тоды можно разделить на следующие типы, показанные на схеме (рис. 1.1).

ХРОМАТОГРАФИЯ

ЖИДКОСТНАЯ СВЕРХКРИТИЧЕСКАЯ ГАЗОВАЯ ФЛЮИДНАЯ

БУМАЖНАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ

Рис. 1.1. Типы хроматографии Результат хроматографического разделения представляется в виде хро-

матограммы.

Хроматограмма и хроматографичеcкие параметры

Хроматограммой называют последовательность пятен, зон или пиков,

соответствующих компонентам исходной смеси после их хроматографиче-

ского разделения. Для любого типа хроматографического процесса (см.

рис. 1.1), в котором для регистрации результата используется детектор, хро-

матограмма представляет собой график зависимости сигнала детектора, про-

порционального концентрациям разделяемых компонентов, от времени (ко-

лоночная хроматография) или расстояния (планарная хроматография). В пла-

нарной хроматографии хроматограммой называют также зафиксированную на бумаге (бумажная хроматография) или на ТСХ-пластинке (тонкослойная хроматография) последовательность пятен компонентов исходной (анализи-

руемой) смеси.

Схема типичной хроматограммы приведена на рис. 1.2. Хроматограмма состоит из пиков, разделенных базовой линией.

Базовая линия соответствует сигналу только от подвижной фазы.

Пик – кривая, в идеале приближающаяся к кривой гауссова распреде-

ления, которая описывает постепенное нарастание концентрации вещества и последующее ее уменьшение.

СИГНАЛ ДЕТЕКТОРА

Рис. 1.2. Хроматограмма и основные хроматографические параметры

1 и 2 – пики соединений 1 и 2; t1 и t2 – соответствующие времена удерживания; t0 – время удерживания несорбирующегося компонента; W1 и W2 – ширина пиков у основания; W0,5 – ширина пика на половине его высоты (предполагается гауссова форма пиков)

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ДАННЫХ

ti – время удерживания компонента – соответствует времени появления максимума пика на хроматограмме, где i – индекс, соответствующий i-му компоненту разделяемой смеси. При точном воспроизведении параметров хроматографической системы время удерживания является величиной, по-

стоянной для данного вещества;

t0 – время удерживания несорбирующегося компонента;

tR = ti − t0 – приведенное (исправленное) время удерживания компонен-

та;

Rr – относительное время удерживания компонента 2 по компоненту 1

Rr t2 t1

t1 и t2 – времена удерживания двух компонентов, измеренные от момен-

та инжекции.

r – относительное удерживание компонента 2 по компоненту 1

rt2 t0 t1 t0

k = (ti – t0)/t0 – коэффициент емкости колонки по i компоненту;

W – ширина пика у основания (для пиков, описываемых гауссовым за-

коном распределения, W = 4 , см. рис. 1.2);

W0,5 – ширина пика на половине высоты (для пиков, описываемых гаус-

совым законом распределения, W0,5 = 2,35 , см. рис. 1.2);

R – разрешение между пиками двух компонентов смеси может быть

или

(W0,5)1 (W0,5)2

При R ≥ 1,5 компоненты разделены полностью (до базовой линии).

Коэффициент p/v (отношение «пик – впадина»)

p/v Hp , Hv

Данное соотношение используют для оценки эффективности хромато-

графической системы, если компоненты смеси разделяются не полностью

(рис. 1.3).

N – число теоретических тарелок, определяется следующими выраже-

ниями:

Hp

Hv

Рис. 1.3. Хроматограмма не полностью разделяемых компонентов

Hp – высота меньшего пика относительно экстраполированной базовой линии;

Hv – высота низшей точки (седловины) кривой, разделяющей пики, относительно экстраполированной базовой линии

Для оценки пригодности хроматографической системы в колоночной

хроматографии обычно используют следующие параметры: R; p/v; N; T; RSD,

–как по отдельности, так и в различных сочетаниях.

Впланарной хроматографии аналогом времени удерживания является фактор удерживания:

где: a – расстояние от точки нанесения пробы до центра пятна; b – расстояние от линии старта до линии фронта элюента.

На экспериментально определяемые значения Rf заметно влияют усло-

вия хроматографирования. Оценкой хроматографической подвижности, ме-

нее чувствительной к влиянию отклонений в условиях проведения экспери-

мента, является величина Rs, представляющая собой отношение величины Rf

одного вещества к величине Rf другого, принятого за стандарт. Величины Rf

и Rs используют для идентификации веществ. Обычно выбор стандарта осу-

ществляется так, чтобы значение Rs анализируемого вещества было в преде-

лах от 0,5 до 2,0. Схема определения этих величин приведена на рис. 1.5.

ЛИНИЯ ФРОНТА

СТАНДАРТ

ОПРЕДЕЛЯЕМОЕ

ВЕЩЕСТВО

ЛИНИЯ СТАРТА УРОВЕНЬ ЭЛЮЕНТА

Рис. 1.5. Схема определения значений Rf и Rs

– место нанесения образца на линию старта

Данные планарной хроматографии могут быть представлены в виде

денситограмм.

Расчет содержания определяемого компонента

Существуют 3 основных метода расчета концентрации анализируемого компонента по хроматографическим данным.

1. Метод нормирования (метод внутренней нормализации, нормировки).

Применение данного метода основано на предположении, что на хрома-

тограмме зарегистрированы все компоненты, входящие в состав анализируе-

мой смеси, и что доля площади (высоты) каждого пика от суммы площадей

(высот) всех пиков соответствует содержанию компонента в массовых про-

центах. Содержание каждого компонента в процентах может быть вычислено по формулам:

Если чувствительность детектора различна по отношению к каждому из компонентов, то вводят поправочные коэффициенты ki. Выражение (8)

приобретает вид:

ki Si

i 1

Поправочные коэффициенты рассчитывают относительно основного компонента анализируемой смеси или другого стандартного вещества по формуле:

где: Сi и С0 – концентрация i-ого компонента и стандартного вещества соответственно;

Si и S0 – площадь (высота) пика i-ого компонента и стандартного вещества соответственно.

2. Метод внешнего стандарта. Готовят раствор стандартного образца определяемого компонента с концентрацией, близкой к предполагаемой ко н-

центрации этого компонента в испытуемой пробе. Последовательно хромато-

графируют стандартный, испытуемый и снова стандартный растворы (каж-

дый не менее 3-х раз). Находят средние значения площадей пиков на хрома-

тограммах и рассчитывают концентрацию определяемого компонента в ис-

пытуемом растворе по уравнению:

Для проведения анализа методом внешнего стандарта необходимо пре д-

варительно убедиться, что в используемом диапазоне концентраций площадь пика определяемого компонента линейно зависит от его концентрации.

3. Метод внутреннего стандарта. Метод внутреннего стандарта ос-

нован на том, что в анализируемую смесь вводят определенное количество стандартного вещества (внутренний стандарт). Это вещество должно быть химически инертным, отсутствовать в анализируемом образце и полностью отделяться от других компонентов смеси. Время его удерживания должно

быть близким к ti определяемых компонентов, концентрация должна быть

близка к концентрациям определяемых компонентов, пик симметричным.

В испытуемый и стандартный растворы вводят равные количества

внутреннего стандарта, хроматографируют и определяют отношения площа-

дей (высот) пиков определяемого компонента к площади (высоте) пика внут-

реннего стандарта в испытуемом и стандартном растворах.

Концентрацию определяемого компонента (Х) рассчитывают по фор-