книги из ГПНТБ / Логинова Л.Г. Физиология экспериментально полученных термофильных дрожжей

но и интенсивность брожения при высокой температуре по­ вышаются.

Однако это влияние отчетливо проявляется только в усло­ виях кратковременного опыта при большом количестве дрож­

ратуры (в течение 90 мин.), при­ обретают повышенную устойчивость к температурному фактору.

Эти изменения не связаны с отбором устойчивых клеток в процессе кратковременного нагревания.

Таблица 7

Брожение подвергнутой нагреванию культуры дрожжей Saccharomyces

79

При дальнейшем культивировании на плотных средах

{четыре пассажа), при температуре 39—40°, дрожжи, подверг­ нутые предварительной температурной обработке, и в последую­ щих поколениях сохраняют способность более энергично раз­

множаться по сравнению с дрожжами, предварительно не прогре­

ваемыми.г

Как показало исследование бродильной функции, дрожжи,

предварительно прогретые, дают более интенсивное брожение

при температуре 39—40° только в кратковременных опытах,

где отсутствует размножение клеток.

Предварительная тепловая обработка оказывает одинаковое

действие как на культуру дрожжей Sacch. cerevisiae, так и на дрожжеподобный организм Torulopsis latvica.

ДЛИТЕЛЬНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ДРОЖЖИ ПОВЫШЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ. ПОЛУЧЕНИЕ ВАРИАНТОВ С НАСЛЕДСТВЕННО ЗАКРЕПЛЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ

Метод адаптации

Для того, чтобы осуществить нормальное спиртовое броже­ ние при 40°, необходимо было получить термофильный вариант дрожжей. Для этого мы избрали метод постепенного приучения дрожжей Sacch. cerevisiae XII расы к повышенной температуре.

Оптимальной температурой размножения и брожения для этой культуры является 28—30°. Поэтому на протяжении всего времени ведения опытов мы постоянно поддерживали свой

контрольный штамм при той же температуре — 28—30°.

Предельной температурой развития дрожжей Sacch. ce­ revisiae XII расы является 40°. При этой температуре заметно угнетаются рост и развитие культуры. При температуре 42° размножение и брожение полностью приостанавливаются. Поэтому в опытах по адаптации мы вначале в пределах от 30 до 38° последовательно повышали температуру на 2°, производя при этом три-четыре пассажа при каждой из них. В дальней­ шем, начиная от 38°, подъем температуры производился с ин­ тервалом в 0,5°. Как показал опыт работы, при каждой из этих температур требовалось много пересевов.

Если при переходе к более высокой температуре наблюда­ лось заметное угнетение развития дрожжей, то адаптируемый штамм снова помещался в условия предшествующей темпера­ туры (например, с 38,5 — снова на 38°). Внешним признаком,

по которому можно было судить о неблагоприятном влиянии повышенной температуры, служил пигмент дрожжей: побуре­ ние осадка свидетельствовало о начинающемся вырождении культуры, и ее требовалось поэтому ставить на время при

80

более низкой температуре. В таких случаях одновременно производились и микроскопические наблюдения всех культур.

Опыты по адаптации выяснили, что различные штаммы одной и той же расы с различной скоростью приучаются к повышенной температуре. По-видимому, индивидуальная из­ менчивость играет здесь известную роль.

В результате проведения этой работы нами была отобрана культура, выделенная из одной клетки, которая легче других адаптировалась к супраоптимальным температурам.

Более успешно адаптация дрожжей протекает, как показали наблюдения, в том случае, когда при пассажах вносится доста­ точно большое количество посевного материала (0,5 мл суспен­

зии дрожжей на 8—10 мл среды).Пересевы производились через двое, в редких случаях через трое суток.

Объем взятой среды при культивировании дрожжей в усло­ виях повышенной температуры также имеет большое значение. Нами этот вопрос был подробно изучен.

Влияние объема среды на скорость селекции дрожжей

В большой популяции создается возможность для возникно­ вения большего числа клеток микроба с новыми свойствами.

Это должно обеспечить быструю селекцию вариантов, наиболее

приспособленных к данным условиям существования. Такое предположение было нами сделано при разрешении

поставленного вопроса. Близкое этому суждение высказал также Пенфольд (Penfold, 1911). Он культивировал Вас. thyphosus в больших и малых объемах дульцит-пептонной среды п обратил внимание на лучшее размножение бактерий в со­ судах большей емкости (о скорости роста автор судил по на­ коплению кислот). Опыты Пенфольда позволяли заключить, таким образом, о большем значении величины популяции кле­ ток, чем это можно было представить. Правда, опыты Пенфоль­ да вызывали и другие соображения: наряду с образованием модификаций и их отбором происходило также образование в клетках Вас. thyphosus адаптивных ферментов.

В наших исследованиях опыты были проведены с той же

экспериментальной культурой дрожжей Sacch. cerevisiae XII

расой, штаммом, выделенным из одной клетки. Питательной

средой служило солодовое сусло 9° Бал., взятое в больших

ималых объемах (1000 мл и 2 мл).

Вкачестве больших сосудов служили плоскодонные колбы емкостью около 2 л. Культивирование дрожжей в небольшом

После двухсуточного брожения во всех опытах учитыва­ лось количество размножившихся клеток. Затем как из боль­ шого, так и из малого объема среды высевалось равное1 коли­ чество клеток на плотную среду (сусло-агар) и дрожжи выра­ щивались при 40°. На третьи или на четвертые сутки от начала размножения подсчитывалось количество образовавшихся ко­ лоний на чашках Петри.

Поскольку почти во всех опытах при высеве из большого объема среды неизменно вырастало при 26° больше колоний, мы принимали их за 100% и выражали все количество выросших колоний в других вариантах опыта в процентах по отношению к этой величине.

Сбраживание солодового сусла проводилось при темпера­ туре 40°. Чашки с сусло-агаром, на которые был произведен высев жидкой культуры из сосудов, выдерживались при тем­ пературе 30 и 40°. Вначале опыты ставились без предваритель­ ного подогрева среды перед посевом дрожжей до этой темпера­ туры, но в дальнейшем она перед посевом подогревалась до

40°. Прогревание важно было проводить для создания совер­ шенно одинаковых условий культивирования дрожжей при по­ вышенной температуре в разных объемах среды.

Как показывают цифровые данные (табл. 8, опыты 5 и 6), -предварительный подогрев среды не’ оказывает, однако, замет­ ного влияния на результаты опытов: так, температура среды в колбах быстро достигала 40° при помещении их в термостат.

Ниже приводятся данные опытов по сбраживанию солодо­ вого сусла с последующим высевом культуры на чашки Петри с сусло-агаром (табл. 8). Величина сосуда и объем питатель­ ной среды не сказалпсь на количестве клеток, однако их

морфология в большом п малом сосудах была совершенно раз­ личной. В сосудах большой емкости большинство клеток содер­

жало гликоген, среди них было мало окрашивающихся метиле­ новой синью. Дрожжи, взятые из малого сосуда, были бедны гликогеном, п среди них встречалось много плазмолизирован­

ных клеток. Таким образом, несмотря на малую количествен­

ную разницу, наблюдалось, как показывало микроскопиро­ вание, плохое состояние дрожжей, развившихся в сосудах ма­ лого объема.

Малый объем среды повлиял на количество выросших ко­ лоний: при высеве на плотные среды их было значительно меньше, чем после предварительного размножения клеток дрожжей в большом объеме.

Средние цифровые данные по всем приведенным опытам (табл. 8) показывают, что при высеве равного количества дрож­ жей на чашки Петри из среды различного объема (1136 мл и 2 мл) во всех без исключения случаях развивалось значительно

82

большого, так и из малого объема среды.

** В опытах № 4 и 5 высев дрожжей сделан из среды после 48-часового брожения.

меньше колоний (в три-четыре раза) после предварительного их размножения в малом сосуде. Посевного же материала было

внесено как в малый, так и в большой сосуд одинаковое коли­ чество — пропорционально объему среды. Следовательно, в обоих сосудах размножающиеся клетки одинаковое время находились в неблагоприятных условиях.

Таким образом, объем питательной среды имеет важное значение при культивировании дрожжей в неблагоприятных

6* 83

условиях (например, при повышенной температуре). Однако нельзя утверждать, что в этом случае происходит только отбор

наиболее приспособленных, уже имеющихся в популяции кле­ ток. Вполне вероятно, что новые условия среды приводят к

возникновению вариантов. Как более приспособленные, они вытесняют исходную культуру.

В результате шестимесячного культивирования при посте­ пенно повышаемой температуре (проведено 72 пассажа) нами была получена культура дрожжей, способная развиваться при температуре 40° (вариант Tj).

Изучение физиологических свойств термофильного штамма дрожжей — варианта Т\ — дало возможность заключить о его высокой сбраживающей способности. К сожалению, в 1941 г. работа была прервана, и культура погибла.

В 1944 г. мы снова приступили к начатым опытам по адап­

тации дрожжей Sacch. cerevisiae XII расы к высокой темпера­ туре. Пользуясь той же методикой, удалось получить вариант дрожжей, энергично развивающийся при 40° (вариант Т2).

Эти работы велись на протяжении 18 месяцев и потребовали

проведения 218 пассажей.

Как и раньше, культивирование этой формы при 40° прово­ дилось на солодовом сусле, но с низким содержанием сахара

(опытное солодовое сусло было 7° Бал.).

В дальнейшем мы пытались экспериментально полученную термофильную форму дрожжей приучить развиваться на соло­

довом сусле с более высоким содержанием сахара —14—

15%.

Целесообразность постановки такого рода опытов диктова­ лась следующими соображениями. Приучение микробов к по­

вышенной температуре, как известно, происходит более успеш­ но на средах, полноценных в отношении питания. Важную роль играет содержание сахара в среде: повышенные его концентра­ ции оказывают защитное действие против высокой температуры. II, наконец, эта среда была близка к производственной.

Методика работы была следующая: вначале пассажи велись при 40° на солодовом сусле с более низким содержанием сахара

(8—10—12—14° Бал.). Затем, по мере приучения дрожжей к повышенной температуре, культивирование проводилось на

более концентрированном солодовом сусле (16—18° Бал.).

В качестве контроля служила культура дрожжей, которая под­ держивалась на той же среде весь период времени, но при тем­ пературе 28—30°. В результате постепенного приучения в те­ чение трех месяцев (проведено 44 пассажа) нами была полу­ чена термофильная форма дрожжей (вариант ;Тз). Этот штамм активно развивался на высококонцентрированном солодовом сусле (16—18° Бал.).

84

Характеристика морфологических и физиологических свойств изучаемых культур приведена в разделе: Морфологи­

ческие и культуральные свойства (стр. 99).

Закрепление свойств термофильности

Первые пассажи дрожжей (варианта Т\) при повышении тем­

пературы до 40° указывали, что они приобрели способность нормально развиваться в данных условиях и накапливать про­ дукты брожения. Однако при первых пассажах малейшее по­

вышение температуры (в десятых градусах) свыше 40° заметно тормозило развитие дрожжей. В таких случаях приходилось иногда температуру культивирования снижать до 39°.

После восьми пассажей при 40° были начаты первые опыты по определению бродильной активности у термофильных ва­

риантов (табл. 9).

Таблица 9

Интенсивность брожения на солодовом сусле культуры дрожжей

Saceharomyces cerevisiae. XII расы, адаптируемой к температуре 40°

Как видно из таблицы, культура дрожжей, развивающаяся при 40°, приспособилась к этой температуре. Она сбраживает

сусло значительно лучше, чем культура, непосредственно пере­ несенная с 30 на 40°.

В последнем случае количество образующегося спирта

вдва раза меньше.

Вдальнейшем адаптированный штамм систематически пере­

севался и поддерживался при 40°. Периодически производи­ лась проверка его бродильной способности. Такие опыты были: поставлены после 14, 23 и 27-го пассажей культуры при 40°.|;

Данные этих опытов сведены в табл. 10. Результаты сбражива-

85

Таблица 10

Интенсивность брожения па солодовом сусле культуры дрожжей

Saccharomyces cerevisiae XII расы, адаптируемой к температуре 40°

с30 на 30° (кон­

ния сусла после 27-го пассажа изображены также в виде кри­ вых (рис. 4).

Цифровой материал с несомненностью доказывает факт

приспособления Sacch. cerevisiae XII расы к высокой темпера­ туре.

Количество выделившейся углекислоты и образованного при брожении спирта, а также и содержание редуцирующих веществ, т. е. несброженного сахара, говорят об адаптации дрожжей к новым температурным условиям. Исходный штамм

при 40° всегда образует значительно меньше спирта. Общее ко­ личество спирта, образованного при 40° адаптированным ва­ риантом, лишь немногим ниже образованного исходной культу­ рой при 30°. Однако даже 27 пассажей оказываются все же недостаточными для полной адаптации дрожжей к темпера­ туре 40°.

86

Приспособившиеся к повышенной температуре дрожжи хотя и размножаются довольно интенсивно, но по сравнению

с дрожжами, культивируемыми при 30°, образуют клеток в единице объема примерно в два раза меньше. Еще меньше число

клеток у исходной культуры, развивающейся при 40°. Одно­ временно с более медленным размножением у адаптированного варианта число мертвых пли ослабленных клеток (окрашиваю­

щихся метиленовой синью) значительно ниже, чем у исходного штамма, который был выращен при 40°.

Рис. 4. Брожение на солодовом сусле куль­ туры дрожжей Saccharomyces cerevisiae

XII расы, адаптированной к повышенной температуре (после 27 пассажей)

1 — с 30 на 40° (1-й контроль); 2 — с 40 на 40° (опыт); 3 — с 30 на 30° (2-й контроль)

Меньшее число окрашивающихся клеток свидетельствует о приспособлении дрожжей к повышенной температуре. В то же время следует отметить более высокий процент мертвых клеток у приученного штамма по сравнению с исходной культу­ рой, развивающейся при 30°. Через 46 час. в культуре исходного штамма, развивающегося при 30°, и у адаптированной культу­ ры, сбраживающей сусло при 40°, образуется приблизительно одинаковое количество спирта, тогда как количество дрож­ жевых клеток в культуре адаптированного варианта в два раза меньше. Ослабление интенсивности почкования у дрожжей говорит о том, что этот процесс очень чувствителен к действию высокой температуры.

Полученные результаты указывают на возможность за срав­ нительно короткий период адаптировать дрожжи к высокой температуре. Этот процесс стойкий. Так, после 27 пассажей при 40° бродильная способность дрожжей не изменилась.

Таким образом, под влиянием высокой температуры в куль­

турах дрожжей одновременно возникают и селекционируются терморезистентные формы.

87

Нами проведены опыты по изучению характера брожения и жизнеспособности дрожжей у исходной расы при дальнейших пересевах при высокой температуре. С этой целью в каждом

опыте по окончании брожения одинаковым количеством клеток

течение двух лет постоянно культивировались в жидкой среде (солодовомсусле) при температуре 28—30°и часто пересевались.

Врезультате исходная раса стала более активной. Бродильная энергия у термофильных дрожжей несколько

снижается при пониженной на 10° температуре культивирова­

ния. Однако при этом заметно интенсифицируется процесс раз­ множения. Так, на мелассном сусле в первом пассаже у адапти­

рованной формы в конце брожения в среднем найдено клеток

64,7 млн. в 1 мл среды, у исходной формы при оптимально!!

для нее температуре культивирования (30°) — 37,2 млн. в 1 мл.

среды.

88