книги из ГПНТБ / Логинова Л.Г. Физиология экспериментально полученных термофильных дрожжей

К различным неблагоприятным факторам среды проявляют большую устойчивость диплоидные, и особенно полиплоидные,

клетки. На это указывают в своих работах Циркл и Тобиас

(Zirkle a. Tobias, 1953), Гонзалец и Баррон (Gonzalez a. Bar­ ron, 1956) и многие другие.

Для успешного проведения процесса адаптации необхо­

димо иметь молодую, размножающуюся культуру. Однако из­ вестны случаи, когда адаптация у микроорганизмов может

проходить и при отсутствии размножения клеток.

В опытах с молодыми, неразмножающимися культурами Динерт (Dienert, 1900) наблюдал образование галактозимазы

у дрожжей, Стефенсон и Стикленд (Stephenson a. Stickland, 1933) — образование гидрогенлиазы муравьиной кислоты у Bacl. coli, Нокс и Поллок (Knox a. Pollock, 1944) — образование тетратпоназы у Salmonella paratyphi В.

При длительном выдерживании неразмножающихся кле­ ток в присутствии стрептомицина они приобретали наслед­ ственную устойчивость к этому веществу (Szybalski, 1954—1955).

Представляет значительный интерес сообщение Брандта,

Фримена и Свенсона (Brandt, Freeman a. Swenson, 1951). Они адаптировали к галактозе дрожжи Sacch. cerevisiae, клетки которых в результате воздействия на них рентгеновыми лу­

чами на 90% утратили способность к размножению. При этом процесс адаптации к галактозе проходил с такой же скоро­ стью, как у дрожжей, не подвергавшихся предварительно облучению.

Более высокую чувствительность к нагреванию проявляют молодые клетки. Так, по наблюдениям Шермана и Альбуса

(Sherman a. Albus, 1923), в молодой культуре Escherichia coli,

подвергавшейся в течение 20 мин. воздействию высокой тем­

пературы (53°), падение числа живых клеток было в 1000 раз больше, чем их убыль в более старой культуре.

Робертсон (1927) изучал устойчивость к нагреванию культур

молочнокислых бактерий различного возраста. Молодые, бы­ стро растущие клетки по сравнению со зрелыми клетками ока­ зались более чувствительными к нагреванию.

Опыты, проведенные Эриксон и Вебли (Erikson a. Webley, 1953) с термофильными штаммами Micromonospora vulgaris,

показали, что вегетативный мицелий старой культуры потреб­ ляет при 60° заметно слабее кислород по сравнению с молодым мицелием одноили двухсуточной культуры.

Отношение к температуре бактерий из группы Coli aero­

действию повышенных температур наблюдается у бактерий более зрелого возраста.

59

имчивости к внешнему воздействию клеток в молодом возра­ сте. Со старением культуры реакция клеток на внешние воз­

действия значительно слабее. Эту биологическую особенность микроорганизмов необходимо учитывать в опытах по приспосо­ блению микробов к температурному фактору.

Значительную роль в процессе адаптации к повышенным температурам играет количество внесенного в среду посев­

ного материала.

Так, например, Касман и Реттгер (Gasman a. Rettger, 1933) получили отрицательные результаты при адаптации споронос­ ных бактерий к высокой температуре, пользуясь при пасса­ жах малым числом клеток. Как сообщает Аллен (1950), ей удалось получить термофильные варианты от мезофильных форм

Вас. polymyxa и Вас. megaterium только в тех случаях, когда

она брала большое количество посевного материала.

Аналогичные наблюдения сделаны при адаптации микро­ бов к самым различным факторам среды. Иерусалимский (1949)

объясняет подобное явление тем, что при засеве большим числом клеток легче устанавливаются окислительно-восстановитель­ ный потенциал и реакция среды, быстрее гидролизуются поли­

вых веществ, витаминов и близких им соединений. При их до­

статке окажутся более благоприятными условия для начала развития клеток микроба.

Большое значение в процессе адаптации к температурному

фактору имеет частота пересевов культуры на свежую среду. Более частые пассажи требуются для поддержания культуры в молодом возрасте, если культивирование ведется при высо­ ких температурах. Так, вследствие значительного ускорения физиологических процессов в клетках происходит более бы­ строе старение культуры (Lyman a. Largwell, 1923; Allen,

1953; Clegg a. Jacobs, 1953 п др.).

Впоследнее время при адаптации микробов к различным новым факторам среды часто пользуются методом проточных культур.

Втаких условиях размножения, когда имеется по­ стоянный приток питательных веществ, а продукты жизнедея­

тельности микробов непрерывно удаляются, клетки длитель­ ное время остаются физиологически молодыми и процесс об­ мена веществ у них проходит достаточно энергично.

Метод проточных культур был успешно использован Мак-

клэнгом (McClung, 1949), Л1оно (Monod, 1950), Дюше и Нё

(Duche et Neu, 1950), Новиком и Сцилярдом (Novick a. Szilard,

60

1950), Малеком (Malek, 1958); Малеком, Восыковой и Вольфом

1957), Г. В. Пинаевой (1957).

Важным фактором, способным оказывать влияние на адап­ тацию микробов к повышенной температуре, является среда для их культивирования. Чем полноценнее она в отношении питательных веществ, тем успешнее происходит процесс при­

учения микробов к новым температурным условиям. Анализ

работ, посвященных изучению группы термофильных микро­ бов, показывает, что эти формы были выделены или из источ­ ников, богатых органическими веществами, или же получены

экспериментальным путем при культивировании мезофильной

формы микроба на полноценной среде в условиях повышенной

температуры (Имшенецкий и Солнцева, 1945 а, б; Иерусалим­ ский и Неронова, 1945).

Аналогичное явление было установлено нами (19526) при изучении свойств термофильных дрожжей, полученных в ре­

зультате приспособления мезофильной формы Sacch. cerevisiae XII расы к высокой температуре. При сбраживании дре­ весных гидролизатов термофильными дрожжами в условиях

повышенной температуры Калюжный, Логинова и др. (1954)

наблюдали более энергичное развитие дрожжей при добавле­ нии к среде повышенного количества фосфорных и азотистых солей, а также экстракта из солодовых ростков, которые вво­ дились в среду в качестве источника витаминного питания.

Высокое содержание сахара в среде повышает устойчи­ вость микроорганизмов к повышенной температуре. Такие наб­ людения многочисленны и не вызывают никаких сомнений.

Защитное действие сахарных растворов проявляется наи­ более эффективно, если их стерилизуют без нагревания, пос­ редством фильтрации через обеспложивающие фильтры. На это

указывают в своих работах Баумгартнер и Воллас (Baumgart­ ner a. Wallace, 1934; Baumgartner, 1938).

Ио поводу защитного действия сахара интересно привести следующее наблюдение. В опытах Мааса (Maas, 1952) мутант Е. coll, развиваясь при температуре свыше 30°, нуждался в

пантотеновой кислоте. Как было выяснено, фермент, синтези­ рующий пантотеновую кислоту, имелся, но был нестойким.

Уже при температуре 25° он быстро инактивировался в том случае, если не был защищен раствором сахара и нейтраль­ ными солями.

Появлению изменений у микробов под воздействием различ­

ных факторов среды может способствовать культивирование их при относительно высокой температуре. Так, Красильников

(1934) показал, что варианты, появляющиеся при нормальной.

G1

II

СОБСТВЕННЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вэтой главе излагаются данные собственных эксперимен­ тальных работ по адаптации дрожжей к повышенной темпера­ туре.

Вкачестве исходного штамма была взята культура дрожжей

Saccharomyces cerevisiae XII раса, которая интересна не только

в теоретическом отношении, но имеет значение для практики.

Sacch. cerevisiae XII раса, выделенная еще в конце прош­

лого столетия, нашла широкое применение в спиртовой про­ мышленности. Она отличается высокой бродильной энер­ гией.

Получение термофильных вариантов микробов, особенно дрожжей, представляет известные трудности. Так, организму приходится приспосабливаться не только к повышенным тем­

Выделение дрожжей из природных условий редко удавалось.

По сравнению с бактериями дрожжевые микроорганизмы, повидимому, труднее приспосабливаются к существованию при повышенных температурах. Пониженный температурный мак­ симум их развития, а также способность большинства из них развиваться при пониженных температурах свидетельст­ вует о том, что эти микроорганизмы не относятся к истинным

термофилам, а представляют группу термотолерантных мик­ робов.

В наши задачи входило не только получение термофильных вариантов дрожжей, но п изучение условий адаптации. Также дается сравнительная характеристика морфологических, физио­ логических и биохимических свойств новых выведенных куль­ тур дрожжей.

63

Опыты размножения ставились также и. в условиях по­ вышенной аэрации, при продувании воздуха. Конструкция

сосудов обеспечивала равномерную подачу воздуха в среду, —

Определение энергии дыхания клеток дрожжей проводилось в приборе Варбурга по обычной методике, но с 1 % дрожжей, считая на отпрессованные.

Из группы дыхательных ферментов был исследован цито­ хром. Для определения цитохрома бралась односуточная куль­ тура дрожжей с солодового сусла (15° Бал.). Дрожжи отделя­ лись на воронке Бухнера и брались в виде отпрессованных.

Спектр поглощения наблюдался в навеске дрожжей определен­ ной толщины (4 мм). По интенсивности полос поглощения можно было судить о количественном содержании цитохрома. Переве­

дение его в восстановленную форму достигалось добавлением гидросульфита.

Энергия брожения дрожжей при получении термофильных

вариантов определялась в кратковременных опытах брожения,

что исключало попутное размножение клеток. Кроме того,

всегда проводилось длительное брожение на солодовом сусле'с учетом конечных продуктов брожения и количества остаточного сахара. Методика проведения длительного брожения — обыч­ ная. Опытные колбы закрывались затворами Мейссля и по ходу брожения взвешивались для учета выделяемого при бро­ жении углекислого газа. Количество накопленного брожением

спирта определялось окислительным методом по Мартену,

остаточный и начальный сахар в солодовом сусле — по Бер­ трану.

Кратковременные опыты брожения проводились при раз­ личных температурах в приборе Одинцовой для исследования процессов брожения (Одинцова, 1949, 1959). Для опыта бра­ лась 24-часовая культура дрожжей, размноженных в жидком солодовом сусле 7° Бал., и 48-часовая, если размножение

проводилось в сусле 16° Бал. Дрожжи отделялись от среды на воронке Бухнера, промывались несколько раз водопроводной во­ дой, отпрессовывались. Опыты ставились по методике Одинцо­ вой (4 % дрожжей, считая на отпрессованные, 4% сахара,, фосфат­

ся Одинцовой, создавало более анаэробные условия брожения.

В некоторых опытах для определения накопленного спирта брожение проводилось на солодовом сусле 7° Бал. В таких

случаях бралось 10 мл среды (вместо 5 мл). Сусло наливалось

в пробирки, которые на время брожения помещались в водя­ ные бани при определенных температурах. Брожение продол­ жалось 6 час., и по ходу брожения через каждые 2 часа про­ изводились определения спирта и остаточного сахара.

Активность бродильного комплекса ферментов изучалась на синтетической среде с глюкозой, гидролитического фермента мальтазы — на той же среде с мальтозой.

Интенсивность брожения в таких кратковременных опытах определялась по количеству углекислого газа, выделяемого дрожжами в единицу времени, в длительных опытах брожения

(с 10% глюкозы) — по количеству образованного спирта и ос­

таточному сахару в конце брожения.

Кратковременные опыты брожения проводились в более широком диапазоне изменения температуры (30, 40, 45 и 55°). Это давало возможность определить термоустойчивость фермен­ тов брожения.

Дополнительно для сравнительной оценки гидролитической

активности мальтазы у исходных (контрольных культур дрож­ жей) и у термофильных вариантов этот фермент был выделен

по методу, описанному А. Н. Белозерским и Н. И. Проскуря­ ковым (1951).

Принятая схема постановки опытов следующая: в колбы Эр» ленмейера емкостью 100 мл вносилось по 5 мл раствора мальтозы (1—2%) и добавлялось различное количество выделенного фер­ мента мальтазы. Колбы с материалом выдерживались в термо­ стате при 40° в течение одного часа, затем определялось коли­ чество образовавшейся глюкозы.

При выяснении потребности термофильных вариантов дрож­ жей и исходного штамма в готовых витаминах к минеральной синтетической среде Ридер с 2% глюкозы, приготовленной на

став этого комплекса витаминов входили: биотин, витамин Вх, витамин В6, пантотеновая кислота, никотиновая кислота, инозит. Они составляют основные ростовые вещества беспиг­ ментных дрожжевых микроорганизмов.

Микроэлементы и витамины были добавлены в оптимальных

концентрациях, в каких они применялись М. Н. Мейселем, Н. А. Помощниковой и Н. П. Трофимовой (1949). На 1 л синте­ тической питательной среды Ридер было внесено: биотина 2 рг,

замещенный 1 г, фосфорнокислый калий двузамещенный 0,1 г,

66

воды 1 л (подробное описание приготовления среды Ридер имеется у Одинцовой, 1959).

Опыты размножения ставились в пробирках с 3 мл питатель­ ной среды, а также в колбах Эрленмейера емкостью 50 мл. В

них наливалось по 4 мл среды. Она распределялась тонким слоем, и размножение в этих условиях проходило при большем^ доступе кислорода воздуха.

Чтобы внести посевной материал, обедненный витаминами, как требует методика при изучении биосинтеза витаминов, дрожжи размножались первые сутки на солодовом сусле и дальше два пассажа проводились на агаровой среде Ридер

без добавления витаминов. Для засева опытных сред бралось минимальное количество двухсуточной культуры с агаровой

синтетической среды при легком прикосновении к культуре

ушком платиновой петли малых размеров.

Размножение на среде Ридер проводилось в течение двух суток при температуре 30° (для исходных культур) и 40° (для опытных культур). Урожай дрожжей определялся по степени мутности суспензии при помощи отечественного фотоэлектри­ ческого нефелометра-колориметра выпуска 1954 г. (ФЭК-1Г—54).

Микроскопический контроль состоял в следующем. Прово­ дились наблюдения под микроскопом за состоянием дрожжевых клеток. Изучались форма и величина клеток дрожжей и их строение. Для рассмотрения ядра готовились препараты, фик­ сированные осмиевой кислотой с последующей покраской железным гематоксилином по Гейденгайну (методика подробно описана Имшенецким, 1940 б). Зерна метахроматина выявлялись с применением прижизненного окрашивания нейтральной крас­ ной. Жир обнаруживался при обработке препарата осмиевой кислотой. Качественная реакция на содержание гликогена в клетках дрожжей проводилась при окрашивании раствором

Люголя. Количество дрожжей определялось методом счета

(в счетной камере Тюрка или Горяева), в некоторых опытах весовым методом или по степени мутности суспензии. Для определения числа жизнеспособных клеток производился вы­ сев на чашки Петри с сусло-агаром и делался подсчет выросших колоний.

Приводимый в таблицах цифровой материал по количествен­ ному учету продуктов брожения в среде, а также по сухому

весу биомассы и количественному учету дрожжевых клеток представляет средние данные из двух параллельных опытов. Повторность каждого опыта была не менее трех-пятикратной.

Укрупненно лабораторные опыты брожения термофильных дрожжей при высоких температурах проводились на ржаных заторах. Последние осахаривались амилолитическими фер­ ментами культур плесневых грибов либо ячменного солода.

5* «7

Культуры плесневых грибов — Aspergillus niger, Asp. oryzae, Rhizopus delemar размножались двумя способами, раз­ рабатываемыми во Всесоюзном научно-исследовательском ин­ ституте спиртовой промышленности: в аэробных условиях на твердой среде — пшеничных отрубях (метод Фенпксовой, 1953)—

и в жидкой среде при подаче кислорода воздуха (метод Вяткина, 1954). При использовании твердой среды простерилизованные пшеничные отруби несколько увлажнялись (1 : 1), вносился посевной материал. Размножение длилось 40 час. при темпера­ туре 30°. Выросший на отрубях мицелий вместе со средой высу­ шивался и измельчался. Для осахаривания опытного затора бралось 6 % такого препарата к весу ржаной муки, как и в производственных условиях.

Глубинные" культуры плесневых грибов выращивались на 20%-ном отваре из пшеничных отрубей пли на грубо отфиль­ трованной барде с добавлением 2% кукурузной муки, в колбах

Эрленмейера на аппарате-качалке (при 160 оборотах в минуту). В каждую колбу вносилось 100 мл жидкой среды. Количество глубинной культуры гриба, вносимой для осахаривания крах­

мала, составляло 50 мл, или 100% от веса муки (в соответствии с методикой Вяткина).

Посев грибов производился в обоих случаях водной взвесью

конидий трехсуточной культуры. Ячменный солод применялся

Сбраживание ржаных заторов проводилось по обычной методике, но при различных температурах, в плоскодонных колбах емкостью 500 мл. Заторы готовились следующим спосо­ бом: к 50 г ржаной муки добавлялось 200 мл водопроводной воды, смесь нагревалась на водяной бане до температуры 70—

80°, а затем в кипящей воде производилась клейстеризация и разжижение затора в течение 10 мин;, после этого колбы закры­

вались ватными пробками и стерилизовались в автоклаве при

1,5 атм. в течение часа. После охлаждения массы в колбах до температуры 50—55° проводилось ее осахаривание в течение 30 мин. при температуре 50—52°. В охлажденный до 30° оса­

крывались затворами Мейссля и ставились на брожение при соответствующей температуре. В качестве контроля проводи­ лось сбраживание заторов культурой дрожжей Sacch. cerevisiae XII расой при температуре 28—29°.

В некоторых опытах с термофильными штаммами первые сутки поддерживалась температура 30°, а затем колбы перено­ сились в термостат на 38—39°. Длительность брожения была

68