книги из ГПНТБ / Логинова Л.Г. Физиология экспериментально полученных термофильных дрожжей

питие термофильных микроорганизмов будет задерживаться при более низкой температуре вследствие затвердевания жиров.

Ненасыщенные жирные кислоты способствуют увеличению проницаемости клеточных оболочек. Такое заключение сделали Трауб и Лихштейн (Traub a. Lichstein, 1956) на основании

неспособности Lactobacillus arabinosus использовать биотин при отсутствии в питательной среде олеиновой кислоты. Эта молочнокислая бактерия — известный индикатор на биотин

идругие витамины группы В при их количественном определе­ нии. Вопрос об участии олеиновой кислоты, а также и других ненасыщенных жирных кислот в качестве существенных фак­

торов роста микроорганизмов обсуждается довольно часто, особ ;нно в последние годы в специальной литературе (Один­

цова, 1959, и др.).

Если придерживаться того взгляда, что с повышением тем­ пературы жизни повышается проницаемость оболочек клеток микробов, то действие в этом направлении ненасыщенных жир­

ных кислот вряд ли будет сказываться на термофилах. По-ви­ димому, этим можно объяснить присутствие в клетках термо­

фильных микроорганизмов насыщенных жирных кислот — более стойких и менее подверженных гидролизу, особенно с повышением температуры. Например, жиры Вас. stearothermophilus, как предполагает Дайер (Dyer, 1953), скорее сфингомпэлпновой природы, нежели типа лецитинов, так как они более устойчивы к гидролизу.

Несмотря на ряд опубликованных в литературе интересных

иценных сообщений, роль насыщенных жирных кислот в клет­

ках Термофилов еще остается пока не совсем ясной.

В содержании липоидов в клетках термофильных и клетках мезофильных микроорганизмов, культивируемых при повы­ шенных температурах, имеются количественные различия (Gaughran, 1947b). Так, при выращивании мезофильных форм Вас. subtilis в условиях повышенной температуры, содержание липоидов в клетках заметно снижалось. В тех же условиях культивирования количество жиров у стенотермофилов не изменялось.

Факты обнаружения насыщенных жирных кислот у расте­ ний и животных, которые существуют в зоне высоких темпе­ ратур, также широко известны (Иванов, 1924; Belehradek, 1931; Fogg, 1956).

Интенсивность обмена веществ

Одйу из главных особенностей термофилов составляет их приспособленность к ускоренному .'обмену. Эта мысль впервые была'" высказана Имшенецким в 1941 г. и затем поддержана

'20

Гаугреном (1947а), Мишустиным (1950), Аллен (1953), Шугар,

Ярмолиньской и Фельтиновским (1955) и многими другими.

Оптимальная температура развития для истинных термофи­

лов значительно выше (на 25—35°), чем для мезофильных мик­ роорганизмов, поэтому термофилы обладают значительно более высокой биохимической активностью.

Процессы роста и размножения у термофилов также про­ ходят с большей скоростью при высоких температурах.

Рост и размножение

Термофилы, в отличие от мезофилов, почти не имеют, как

выяснилось, начальной стационарной фазы. Имшенецкому и Солнцевой (1944), Гаугрену (1947а) и другим не удалось обна­ ружить лаг-фазу у ряда термофилов.

Как указывает Гаугрен, время генерации термофилов нахо­

дится в пределах от 5 до 15 мин. Поэтому для поддержания тер­ мофильной культуры в активном состоянии необходимо про­ водить частые пересевы.

Рост и размножение непосредственно связаны с группой дыхательных ферментов. У термофилов, приспособленных к жизнедеятельности при повышенных температурах, эти фер­ менты полностью соответствуют биологии организма. В пользу такого положения говорят данные Эдвардса и Реттжера (Ed­ wards a. Rettger, 1937): максимальная температура роста тер­ мофильных бактерий, по их наблюдениям, близка к темпера­ туре, при которой начинается инактивация дыхательных фер­

ментов. Подобного рода указания имеются и в более поздних работах (Allen, 1953, и др.).

Имшенецкий (1944), Имшенецкий и Авдиевич (1944), Имшенецкий и Солнцева (1945) установили, что ускорение биохи­ мических процессов, вызываемых термофилами, у большинства из них находится в прямой зависимости от скорости размно­

жения.

Существенное влияние на скорость протекания этих про­ цессов оказывает также и быстрое освобождение ферментов из клеток. Оно обусловлено быстрым старением последних; и их распадом.

У многих термофильных бактерий процесс размножения в определенных температурных границах довольно закономерно подчиняется правилу Вант-Гоффа, т. е. находится в прямой зависимости от температуры (Имшенецкий, 1944). Однако за­ кон Вант-Гоффа, распространяющийся на химические реак­ ции, может быть приложим лишь с большими поправками к

биологическим процессам.

21

Биохимическая активность

Гансен (1933)? определил энергию брожения факультатив­

ных термофилов. Оно проходило с исключительной быстротой при 55° и ускорялось в 33 раза в сравнении с бродильной ак­ тивностью мезофильной формы Streptococcus lactis при 20°.

По данным Имшенецкого (1944), протеолиз, денитрифика­ ция, гидролиз крахмала и разложение целлюлозы, осуществ­ ляемые термофильными бактериями, проходят в 7—14 раз бы­

стрее, чем у мезофильных форм. Многие термофилы способны с большей скоростью также производить гидролиз жиров, сбра­ живать различные сахара и т. п.

По наблюдениям Егоровой (1942, 1946). термофильные

бактерии, окисляющие фенол, в пять раз ускоряли этот про­ цесс при 55—60° в сопоставлении с деятельностью мезофиль­ ных бактерий при обычных температурах.

Подобных примеров в литературе имеется большое число. Общебпологический интерес представляет вывод о более высоком температурном максимуме для энзиматических процес­ сов у этих организмов по сравнению с температурным макси­ мумом для их роста и размножения (Имшенецкий, 1944; Ми­

шустин, 1950; Christophersen u. Precht, 1950).

(1949) были установлены известные различия в характере дей­ ствия ферментов в зависимости от температуры: с ее повыше­ нием в клетках наблюдается преобладание синтетических про­ цессов над гидролитическими.

Курсанов предполагает, что временное ослабление гидро­ литических процессов в клетке является защитным приспособ­ лением, которое предохраняет протоплазму от чрезмерного воз­ растания осмотического давления клеточного раствора в усло­ виях высокой температуры. При этом изменяются адсорбцион­ ные свойства клеточных структур и происходит перераспреде­

ление ферментов в растворе.

При адсорбции ферментов, как было показано (Опарин,

Курсанов, Сисакян, Рубин), в клетке начинают преобладать

синтетические процессы.

Свойства ферментов

Различные ферментные системы, а также отдельные фермен­ ты термофилов не одинаково относятся к действию высокой

температуры. Менее стойкими к повышенной температуре ока­ зались ферменты дыхания, и в особенности ферменты броже­ ния. Более устойчивы гидролитические ферменты.

22

Гидролитические ферменты, большая часть которых может быть легко обнаружена в окружающей клетку среде, наиболее полно изучены. Они представляют большой интерес для практики.

Высокой термостабильностью отличаются амилазы, полу­ ченные из различных видов термофильных микроорганизмов. Оптимальная температура действия амилаз достигает 70—80° (Oprescu, 1898; Coolhaas, 1928; Имшенецкий, Солнцева и

Кузюрина, 1942; Боярская, 1942; Проскуряков и Дмитриев­

ская, 1949; Starck a. letrault, 1951; Hartman, Wellerson а.

Tetrault, 1955; Hartman a. letrault, 1955).

Интересны исследования Кемпбелла (1954b, 1955), кото­ рому удалось получить очищенные препараты а-амилазы из культуры Вас. coagulans, развивающейся при 35°, и из Вас. slearothermophilus, хорошо растущей при 55°. а-Амилаза, выде­ ляемая бактериями в среду при 35°, имела оптимум активности

при 45—55°. После нагревания в течение часа при температуре

90° активность этого фермента снижалась на 90—92%. У ами­ лазы термофильного организма оптимум активности лежал при 60—70° и нагревание при 90° в течение часа снижало актив­ ность лишь на 6—10%.

Повышенная активность мальтазы у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeXII расы, адаптированных к температуре 40°, была

отмечена нами (Логинова, 1952а). Этот фермент обладает боль­ шей устойчивостью к действию высокой температуры по срав­ нению с мальтазой, выделенной из мезофильной формы.

Прингсгейм (Pringsheim, 1912, 1913) изучил действие цел­

люлазы термофильных бактерий; этот фермент производил гид­ ролиз целлюлозы при температуре 70°. На основании исследо­ вания, проведенного Имшенецкпм (1940а), целлюлаза может быть отнесена к группе так называемых конститутивных фер­ ментов: ее активность не исчезает при культивировании бакте­ рий на средах без клетчатки.

Значительно выше термоустойчивость протеолитических

ферментов у термофилов. Это показано работами Т. В. Аристовской (1948). Аналогичные указания имеются в работах Броцкой

(1945, 1946а, б, 1947), Гордона и Смита (Gordon a. Smith, 1949),

Рида (Reed, 1957), Обриена и Кемпбелла (O’brien a. Campbell,

1957).

К более ранним относятся исследования Опреску (Oprescu,

1898), Берджи (Bergey, 1919), Фейрера (Feirer, 1927), Блека и Таннера (1928), Прикетта (1928), Пейна (Paine, 1931).

О высокой устойчивости протеолитических ферментов к тем­ пературному фактору свидетельствует также и многочислен­ ная литература по хранению пекарских прессованных дрожжей

в высушенном состоянии: часто происходит протеолиз, вслед­ ствие чего их трудно сохранять длительное время.

23

Для характеристики свойств протеолитических ферментов термофильных микроорганизмов интересно привести работы Чопра (Chopra, 1946а, Ь). Автором были изучены протеиназы

трех типов бактерий: Вас. thermophilus, Вас. aerothermophilus и Вас. thermoaciduricans. Протеиназы, выделенные из клеток

этих бактериальных организмов, принадлежали к группе триптаз.

По сравнению с гидролитическими ферментами ферменты, участвующие в процессах аэробного дыхания и брожения (ана­ эробного дыхания), более чувствительны к высокой темпера­ туре. Поэтому окислительно-восстановительные процессы при высокой температуре угнетаются значительно раньше, нежели гидролитические.

При сравнительном изучении группы дыхательных фермен­ тов у термофильных и мезофильных организмов было пока­ зано, что ферменты термофилов обладают большей резистент­ ностью к действию высокой температуры. За последние годы

систематические работы в этом направлении были проведены Милитцером и его сотрудниками (1949, 1950, 1951, 1952, 1954),

Джеорджи, Милитцером, Бэрнсом и Хеотпсом (Georgi, Militzer, Burns a. Heotis, 1951), Марчем и Милитцером (March a. Mililzer, 1952, 1956a, b), Д. Брауном, Милитцером и Джеорджи

(1957). Они изучили термостабильность дыхательных фермен­ тов (молочной дегидразы, цптохромоксидазы, цитохрома Ь,

цитохрома с, сукциноксидазы, альдолазы, апиразы и др.) у

штамма Вас. slearothermophilus, который мог расти в широком диапазоне температуры. Максимальная температура его раз­ вития была 60—65°.

Эти ферменты, как было установлено, не инактивировались при 65°.

В дальнейших исследованиях Милитцер и Тэтл (Militzer a. Tuttle, 1952) показали, что аденозинтрифосфатаза, яв­

ляющаяся составной частью апиразы, сохраняется при 65°

и медленно инактивируется лишь при 75°.

Добавление ионов магния частично восстанавливает актив­

ность аденозинтрифосфатазы, и поэтому было высказано пред­

положение, что ионы магния играют определенную роль в ста­ бильности фермента к нагреванию.

Милитцер и Бэрнс (1952, 1954) исследовали ферменты изоли-

монного цикла Кребса у Вас. stearothermophilus. Ферменты этих

бактерий — цитохромоксидаза, аденозпнтрифосфатаза, альдолаза и молочная дегидраза оставались активными при 60—65°. Исклю­ чение представляла оксидаза пировиноградной кислоты. Уже при температуре 60° происходила ее инактивация: при нагре­ вании в течение 15 мин. активность была снижена на 12% и

резко ослаблялась после нагревания в течение часа.

24

По мнению Милитцера и Бэрнса, оксидаза пировиноград­ ной кислоты в клетках в значительно меньшей степени подвер­ гается инактивации. Как было выяснено, более высокая ее ста­ бильность связана с присутствием в среде магния и кислорода.

Д. Брауном, Милитцером и Джеорджи (1957) изучалась устой­ чивость к нагреванию фермента пирофосфатазы у Вас. stearothermophilus, размноженного при температурах 40, 50, 60

и 70°. Более высокой устойчивостью к нагреванию обладал фермент, выделенный из культуры, растущей при 70°. г1аким образом, как в этой работе, так и в ряде других (Thomp­ son, Zobel, Georgi a. Militzer, 1957, и др.) было показано, что

устойчивость ферментов к нагреванию коррелирует с темпера­ турой размножения микроба.

В этом плане интересны исследования Эдвардса и Реттжера (1937). Ими была изучена группа дыхательных ферментов

(индофенолоксидаза, каталаза и сукциндегидраза) у термо­

фильных штаммов бактерий, для которых средняя максималь­

ная температура роста была 76°. Как выяснилось, индофенолок­ сидаза этой бактерии разрушается при 65°, каталаза — при

67° и сукциндегидрогеназа — при 59°. Таким образом, данные ферменты инактивировались при температуре, близкой к мак­ симальной температуре роста этих микроорганизмов.

Активность дыхательных ферментов связана с видовыми особенностями микроорганизмов. В качестве одного из таких примеров могут быть названы Вас. subtllis и Вас. circulans.

Аллен (1950) определяла активность некоторых дыхательных ферментов (как в неповрежденных клетках, так и вне клеток) у этих термофильных организмов. Менее стабильными к высокой

температуре оказались дыхательные ферменты Вас. subtllis. Чрезвычайная термостабильность декарбоксилаз амино­

кислот у Escherichia coli и каталазы у Вас. mycoides была отме­ чена Мишустиным (1950). Из этих двух ферментов более устой­ чивой к повышенной температуре оказалась дегидразная си­ стема.

Не могут не привлечь внимания работы Мишустина и егосотрудников (1946, 1950) и Фейрера (1927) по эколого-геогра­ фическому распространению микробов в почвах. Проведенными исследованиями было достаточно убедительно показано разли­

чие в дыхательных ферментах в зависимости от ареала распро­

странения: у микроорганизмов, обитающих в почвах южных районов, активность дыхательных ферментов значительно сла­ бее по сравнению с микроорганизмами, обитающими в зонах низких температур. Подобная зависимость была отмечена в отношении каталазы, пероксидазы и дегидраз также у микро­ скопических грибов — Mucor situations, Mucor ramannianus, Cladosporium herbarum (Арпстовская, 1948).

25

Связь ферментов клеток с температурными условиями имеет, по-видимому, общий характер и наблюдается как в мире микро­ бов, так и в мире высших растений и животных (Елизарова,

лили термостабплыюсть фермента аспарагин-деамидазы, вы­ деленной из мезофильной формы Вас. coagulans и термофильной

Вас. stearothermophilus. Фермент, выделенный из мезофильного

штамма, обладал более низкой термостабильностью. Зак, при

нагревании в течение 40 мин. при 55° без субстрата его актив­ ность снижалась на 83%, в то время как активность фермента, выделенного из термофильной культуры, в аналогичных усло­ виях опыта снижалась всего лишь на 29°.

Наибольшей чувствительностью к действию высокой тем­ пературы обладают ферменты брожения. Однако в процессе

адаптации к высокой температуре эти ферменты также стано­ вятся более терморезистентными. В наших опытах (1952а)

с культурой дрожжей Sacch. cerevisiae XII расой, адаптиро­

ванной к 40°, устойчивость зимазного ферментного комплекса была значительно повышена.

Сравнительные исследования биохимических свойств тер­ мофильных и мезофильных микроорганизмов, как показывает приведенный экспериментальный материал, особенно плодотвор­ но и интенсивно развивались в направлении изучения свойств

отдельных групп ферментов. Накопленный материал позво­ лил Меннингу и Кемпбеллу (1957) приступить к систематиза­

ции его и распределению ферментов на группы. Они предло­

жили деление ферментов термофильных микроорганизмов по степени их чувствительности к температуре на три группы.

Первую группу составляют внутриклеточные и внеклеточ­ ные ферменты, которые стабильны при температуре от 55 до 65°, по инактивируются при более повышенных температурах

Tuttle, 1952; O’brien a. Campbell, 1957).

Ко второй группе относятся внутриклеточные ферменты, ко­ торые инактивируются при высокой температуре, когда отсут­ ствуют защитные вещества в среде (Allen, 1950; Militzer а. Burns, 1954; Manning a. Campbell, 1957).

В третью группу вошли высокоустойчивые к нагреванию внеклеточные ферменты, такие, как а-амилаза (Campbell,

1954b; Hartman, Wellerson a. Tetrault, 1955).

При сравнительном изучении у термофилов свойств отдель­

ных ферментов, выделенных из клеток при их разрушении и находящихся в неповрежденных клетках, обнаружена их раз­

26

личная биохимическая активность (Имшенецкий, 1944; Мишу­ стин, 1950). Скорость ферментных реакций была значительно выше, если фермент работал вне клетки. По-видимому, фер­

ментные процессы, протекающие внутри клетки, имеют сопря­ женный характер и действие их обусловливается как внутри­ клеточной, так п внешней средой. Взаимосвязь этих процессов наглядно показана И. Л. Работновой (1957).

Были исследованы некоторые ферменты бактериальных спор. Они обладают, как было показано, большей устойчиво­ стью к нагреванию по сравнению с выделенными из вегетатив­ ных клеток тех же микроорганизмов. Полученные данные ка­ саются каталазы Вас. terminalis (Lawrence a. Halvorson, 1954)

и аланинрацемазы спор той же бациллы (Stewart a. Halvorson,

1953, 1954).

МЕХАНИЗМ УСТОЙЧИВОСТИ ТЕРМОФИЛОВ

Действие температуры на клетки мезофилов

Изменение температурного режима оказывает значитель­ ное влияние на скорость физиологических процессов, протекаю­ щих в живых клетках. С повышением температуры скорость этих процессов значительно увеличивается, подчиняясь в оп­ ределенных температурных границах правилу Вант-Гоффа.

Было установлено, что скорость ферментативных процес­ сов при повышении температуры на 10° возрастает примерно в

два раза. Так, например, поданным Оппенгеймера (Oppenheimer,

1925—1939), Qlo для дрожжевой инвертазы в интервале между

10 и 20° равен 1,7; между 30—40°—1,6. Аналогичным образом повышается скорость спиртового брожения при изменениях температуры от 10 до 40° (Slator, 1908).

Исследуя расы дрожжей, культивируемые при повышен­

ных температурах, Н. А. Красильников (1934) обнаружил их более высокую протеолитическую активность. Клетки дрож­ жей, размноженные при обычной температуре, содержали ме­

нее активные протеолитические ферменты. Повышение актив­

ности фермента трансаминазы в прорастающих спорах под воздействием теплового шока было отмечено Фальконе и Ка-

рачо (Falcone а. Сагасб, 1958).

Шварц, Каплан и Ламборг (Swartz, Kaplan a. Lamborg, 1958) сообщили об активировании теплом фермента пирофос­ фатазы, выделенного из клеток Proteus vulgaris.

Огие и Скотт (Ohye a. Scott, 1953) изучили влияние темпе­ ратуры от 10 до 50° на скорость роста 20 штаммов Clostridium botulinum. Лаг-фаза оказалась наименьшей при 37°, несколь­ ко увеличенной при 42,5° и значительно увеличенной при тем­

27

пературах ниже 20°. Общий урожай клеток был наивысшим

при 37°.

Дж. Уайт (1957) определил скорость размножения дрожжей

в зависимости от температуры. Наибольший коэффициент раз­

быстро снижалась и при 40° была равна 0,2. При температуре 20° коэффициент размножения равнялся 0,149.

В работе Дж. Уайта (1952) было показано, что процентной

содержание сухого вещества в клетках дрожжей возрастает с повышением температуры размножения от 20 до 43°.

К этой же группе относится работа А. Я. Мантейфель и В. А. Антышевой (1935). Изучалось влияние температуры на интенсивность ацетонобутилового брожения. С увеличением температуры от 22 до 40° активность брожения, как было най­ дено, заметно возрастала.

Таким образом, повышение температуры до определенного температурного предела способствует интенсификации различ­ ных функций клеток у микроорганизмов. Выше этого предела

нарушается обмен веществ и происходит дегенерация клеточ­

ного протопласта,

По действию теплового фактора на дрожжевые организмы имеются данные Мейселя и сотрудников (1955). При высоких температурах нарушение обмена веществ раньше всего прояв­ лялось в торможении функции роста и размножения, при этом оказалась менее чувствительной способность клеток к росту, чем к их размножению.

Механизм, при помощи которого клетки термофилов защищаются от температуры

Термофилия микроорганизмов обусловлена многими спе­ цифическими особенностями организации их клеток — мор­ фологическими и физиолого-биохимическими. При более вни­ мательном рассмотрении этих приспособительных механизмов, описанных в литературе, представляется возможным охарак­ теризовать их следующим образом.

1.Термофилы обладают большей способностью к ресин­ тезу основных компонентов протоплазмы и ферментов, которые повреждаются высокой температурой.

2.По сравнению с мезофильными формами протеины и фер­

менты термофильных микроорганизмов более устойчивы к на­

греванию.

3. Термофилы обладают защитными веществами, которые предохраняют протеины от денатурации.

28