книги из ГПНТБ / Логинова Л.Г. Физиология экспериментально полученных термофильных дрожжей

свойства стойко сохраняются ими после многократных пересе­ вов при температуре 39—40° в течение 13 лет.

Анализируя состояние культур и их активность как в на­

чальные периоды их адаптации к высокой температуре (недели, месяцы), так и в более длительные сроки (годы), мы убежда­ лись, что на протяжении нескольких лет у них повышалась устойчивость к температурному воздействию. Этот процесс со­ провождался и повышением общей физиологической активности культуры.

Внаших опытах получения термоустойчивых штаммов дрож­ жей можно было наблюдать, как постепенно изменялась функ­ ция размножения у дрожжей при длительном воздействии по­ степенно повышаемой температурой.

Врезультате двухлетнего культивирования на солодовом

сусле при температуре 40° было обнаружено, что количество

размножившихся клеток у адаптированной формы дрожжей к концу брожения бывает вдвое меньше, чем у исходной расы

в условиях брожения при обычной температуре (28—30°). Однако спустя восемь лет количество размножившихся клеток

к концу брожения было равно контролю. Следовательно, про­ цесс почкования у адаптированной формы дрожжей заметно

усиливался.

При адаптации температура оказывает вначале неблагопри­ ятное действие на организм. В клетке в первую очередь нару­ шается нормальный синтез нуклеиновых кислот. Это приводит к ослаблению и замедлению процесса роста и деления клеток.

Но, постепенно адаптируясь к температуре, микроорганиз­

мы приобретают способность к ускоренному синтезу нуклеи­ новых кислот, что сопровождается ускорением обмена веществ.

О более ускоренном синтезе нуклеиновых кислот клетками ми­ кроорганизмов, адаптированных к высокой температуре, сви­ детельствуют данные Уэллерсона и Тетро (1955).

Дж. Уайт (1952, 1957) изучали скорость потребления сахара у дрожжей при сбраживании пивного сусла при различных тем­ пературах (от 20 до 40°). Скорость ассимиляции у дрожжей была максимальной при 36°, в то время как для процесса сбраживания

этот максимум лежит выше 40°. Аналогичные указания имеются и у ряда других исследователей.

Имшенецкий (1944, стр. 8) по этому поводу пишет: «Теорети­ чески вполне вероятно, что при некоторой высокой темпера­ туре размножение клеток уже начинает тормозиться, тогда

как биохимические превращения не только будут продолжаться

вкультуре, но могут протекать весьма активно».

Впроцессе адаптации бывает несколько труднее проследить за изменением бродильной функции у дрожжей, так как мы

сталкиваемся в этом случае не только с действием температуры

12* 179

как фактора, изменяющего жизнедеятельность клеток. Наряду с этим происходит ускорение ферментативных реакций, кото­ рое подчинено в известной мере правилу Вант-Гоффа. На уско­ рение спиртового брожения при высоких температурах ука­ зывают п данные Слатора (Slator, 1908).

В наших опытах в течение многократных пересевов при по­ вышенной температуре бродильная функция полученного тер­

мофильного варианта дрожжей не ослаблялась, а даже несколь­ ко усилилась и состояние клеток было хорошее. Это свиде­ тельствовало об адаптивном характере изменения бродильной функции у дрожжей.

С теоретической точки зрения возможность получения в ла­ бораторных условиях различных вариантов термофильных мик­ роорганизмов из мезофильных форм представляет большой интерес.

Накопленный опыт в области изучения наследственных из­ менений у микроорганизмов заставил многих исследователей от­ казаться от утверждения о возможности лишь мутационной из­ менчивости. В настоящее время защитники этих теорий при­ знают и другой путь наследственных изменений — адаптивную

изменчивость.

В нашей работе показано, что устойчивые к высокой тем­ пературе формы не предсуществовали в популяции. Исследо­ вания проводились с чистой культурой дрожжей, выделенной из одной клетки.

Под воздействием постепенно повышаемой температуры в процессе роста и развития культуры клетки изменялись. При этом количественные и качественные изменения происхо­

дили постепенно и в дальнейшем требовался еще довольно дли­ тельный период, чтобы вновь возникшие у дрожжей свойства закрепились и стали устойчивыми.

Продолжительный процесс адаптации дрожжей к новым условиям существования сопровождался как изменением куль­ туры, так и селекцией терморезистентных вариантов.

Таким образом, показано, что температура является мощным селекционирующим фактором среды.

Высказанные некоторыми учеными представления о воз­ можном возникновении в процессе адаптации многоступенчатых мелких мутаций многими оспариваются (Dean a. Hinshelwood, 1954, 1957, и др.).

Появление новых свойств у дрожжей, по-видимому, носит наследственный характер. Так, после длительного культиви­ рования при температуре 40° в течение 13 лет свойство термофильности у дрожжей стойко сохраняется. При перенесении культуры в условия пониженной температуры (28—30°) и при длительном (в течение года) поддержании ее в указанных ус-

180

ловлях лишь в слабой степени утрачивались свойства термофильности.

Нами были предприняты попытки получить термофильную

форму дрожжей, способную развиваться и при более высокой

температуре. Эта задача оказалась наиболее трудной.

Пересевая через каждые 24 часа дрожжи, адаптированные к температуре 40°, при очень медленном подъеме температуры (интервал в 0,5°), нам удалось через семь месяцев добиться раз­ вития указанной культуры при 44°. Однако в процессе веде­

ния пассажей пришлось отказаться от среды с низким содер­

жанием сахара (7° Бал.) и вести пересевы только на сусле

16° Бал., так как среда с более высоким содержанием сахара оказалась более благоприятной для развития культуры при температуре 44°.

Полученная культура отличалась от исходной термофиль­ ной расы, развивающейся при температуре 40°, значительно меньшей активностью. Термофильный вариант пересевался в течение четырех лет при температуре 43—44°, но более повы­ сить его резистентность не удалось.

Вариант дрожжей, развивающийся при температуре 44°,

не удалось адаптировать к более высокой температуре — 45— 46°. После ряда пассажей при этой температуре культура погибла. Таким образом, для нашей экспериментальной куль­ туры дрожжей Sacch. cerevisiae XII расы эта температура ока­ залась предельной.

Была замечена интересная особенность у термофильной формы дрожжей, развивающейся при 44°, которая ранее в ли­ тературе не отмечалась. Так, при сбраживании высококонцен­ трированного солодового сусла при температуре 39—40° двумя термофильными расами дрожжей (адаптированными к 40 и 44°), процесс размножения и брожения, как было установлено, проходил интенсивнее у дрожжей, предварительно размно­ женных при более высокой температуре.

Объяснить значительную стимуляцию процесса размножения у изучаемых термофилов при пониженной температуре пока

трудно. Некоторую аналогию, как нам представляется, мы мо­ жем провести с явлением такого рода при предпосевной закалке семян против засухи, мороза и других действующих на клетку факторов. В настоящее время доказано (Генкель, 1946), что ра­ стения, которые получают предпосевную закалку, значитель­ но лучше переносят действие различных неблагопрятных фак­ торов. Такая, даже кратковременная, обработка сопровождается рядом морфологических и физиологических изменений у ра­

стения. При этом процессе ускоряется, в частности, обмен

веществ. Весьма вероятно, что при резких изменениях темпе­ ратуры (когда дрожжи, развивающиеся при 44°, помещены

181

в более пониженную температуру —40°) мы сталкиваемся с явле­

нием так называемого синхронного почкования.

За последнее время в литературе сообщены методы, при помощи которых удается вызвать синхронное деление у микро­ организмов. Наиболее часто описываются случаи, когда син­ хронное деление у микроорганизмов вызывается кратковре­ менными, но резкими изменениями температуры. Подобное явление, вызываемое прерывистой обработкой теплом и охлажде­ нием, наблюдали многие.

В результате приспособления культуры дрожжей Sacch. cerevisiae ХП расы к весьма сложному комплексу новых усло­ вий, возникших в среде в результате воздействия повышенной температурой, у последних произошли глубокие изменения в обмене веществ. Одновременно с этим изменялись морфологи­ ческие и культуральные особенности дрожжей. Клетки дрож­ жей, адаптированные к повышенной температуре, меньше по величине и более округлой формы.

Судя по литературным данным, эти особенности присущи

большинству термофильных микроорганизмов. Как известно, клетки меньшего размера обладают большей относительной поверхностью и это дает возможность термофилам быстрее осуществлять процессы метаболизма. Меньшего размера и их колонии. Такие морфологические изменения, возможно, свя­ заны с пониженной активностью цитохромоксидазной системы. Подобного рода указания содержатся в работе Сюсман (1953).

Имеются заметные различия и в цитологических особен­ ностях дрожжей. Ядра у клеток термофильных вариантов большего размера и более полиморфны, чем у мезофильной расы. Аналогичные наблюдения были сделаны Кировой (19536).

Как было установлено Мейселем (1938, 1950), увеличение размеров ядер клеток дрожжей наблюдается при переходе от аэробных условий существования к анаэробным. Большее уве­ личение ядер клеток термофильных дрожжей по сравнению

с мезофильной (исходной) формой свидетельствует о большей

перестройке на бродильный тип, о большей приспособленно­ сти, следовательно, к жизни при недостатке в среде кислорода воздуха. Это коррелирует и с перестройкой основного обмена на бродильный тип.

Клетки термофилов содержат больше жировых включений. При длительном культивировании термофильной и исход­ ной форм дрожжей при соответствующих температурах, в жидкой среде — солодовом сусле 16° Бал.— наблюдается зна­ чительное ослабление процесса спорообразования у обеих

форм. Возможно, что при переведении культур на плотные среды и при соблюдении других условий, более благоприятных для спорообразования, этот процесс удастся усилить.

182

Одной из основных отличительных особенностей термофиль­ ной культуры дрожжей является значительно большая способ­ ность переносить высокую температуру по сравнению с ис­ ходной мезофильной расой. При этом ускоряются основные физиологические процессы, протекающие в клетке. Усиливает­ ся образование спирта, увеличиваются скорость роста и раз­ множения клеток. Таким образом, основное свойство, присущее всем термофильным организмам, распространяется и на экс­ периментально полученную нами форму дрожжей.

При брожении на средах в условиях пониженной темпера­ туры (28—30°) адаптированные к повышенной температуре варианты дают одинаковый с исходной, неадаптированной куль­ турой или несколько пониженный по сравнению с ней выход продуктов брожения, но размножаются в полтора-два раза

быстрее и накапливают большую биомассу. Учет сухого веса биомассы как тех, так и других дрожжей подтверждает это

положение. Если сухой вес дрожжей исходной расы в среднем принять за 100%, то у экспериментально полученной формы за этот же промужуток времени (72 часа) накапливается биомас­

сы 120,72%. Это свойство адаптированные дрожжи сохраняют на протяжении многократных пересевов. Подобная закономер­ ность наблюдается и при размножении в условиях повышенной

аэрации — в жидких средах, с продуванием воздуха. Приведенный факт, несомненно, заслуживает внимания не

только в теоретическом отношении. Возможность увеличения биомассы представляет значительный интерес для дрожжевого производства.

Китайские ученые (Chien Tswen-rou a. Fang Hsing-fang

1959), основываясь на наших данных, адаптировали к высокой температуре дрожжи Torulopsis utilis, Candida tropicalis и не­ которые другие культуры, применяемые для кормовых целей. Размножение полученных термофильных культур при понижен­ ной температуре (28°), т. е. в прежних (обычных) температур­ ных условиях, дало возможность значительно увеличить их биомассу. Указанные формы были успешно использованы в сельскохозяйственной практике.

Вопрос об отношении различных групп ферментов к дей­ ствию высоких температур интересовал многих исследователей,

В настоящее время с достоверностью установлено, что ферменты дыхания более чувствительны к высокой температуре,

чем гидролитические ферменты.

Как показали наши данные, у изучаемых термофильных дрожжей значительно ослаблено аэробное дыхание и редуци­ рована цитохромная система. Следовательно, в процесе адапта­ ции к повышенной температуре у них создавались системы, ко­

торые обеспечивали им возможность существовать в условиях

183

повышенного анаэробиоза (при повышенной температуре рас­ творимость кислорода в среде значительно снижается). Такими системами оказались ферменты брожения и гидролитические

ферменты, например мальтаза.

Клетки термофильного варианта дрожжей, полученного нами,

обладают более активным и более устойчивым к повышенной температуре комплексом ферментов брожения. Это компенси­ рует в энергетическом отношении значительно ослабленное аэробное дыхание.

Таким образом, в процессе приспособления микроорганиз­ мов к повышенной температуре, наряду с угнетением фермен­

тов аэробного расщепления углеводов, у них вырабатываются более стойкие к высокой температуре ферментные системы, обеспечивающие жизнь в условиях недостатка кислорода воз­ духа.

При длительном культивировании в условиях повышенной температуры на среде, содержащей мальтозу, дрожжи приобре­ ли способнось накапливать активную мальтазу. Так, мальтаза термофильного варианта оказалась значительно более активной по сравнению с мальтазой исходной (мезофильной) культуры.

Рубпн и Соколова (1949, стр. 378), изучая взаимоотношения

•между процессами превращения углеводов картофеля при вы­ соких температурах, установили, что «...в явлениях приспособ­

ления к температурному режиму ферментный аппарат расте­ ния играет существенную роль, причем приспособление это идет через смещение температурных оптимумов действия фер­

ментов». Очевидно, и в нашем случае имеется аналогичное яв­ ление в процессе приспособления дрожжей к повышенной температуре.

Полученный нами термофильный вариант дрожжей отли­ чается от исходной (мезофильной) культуры иными синтетиче­ скими способностями к витаминам. Изменения касаются в ос­ новном пантотеновой кислоты и витамина В6.

Термофильный вариант приспособлен к более высокому синтезу пантотеновой кислоты. Наряду с этим способность к синтезу витамина В6 резко снижена, и на средах, лишенных этого витамина, он дает очень слабый рост.

Такие изменения потребностей в готовых витаминах были отмечены Одинцовой у представителей вида Sacch. carlsbergensis в сопоставлении с представителями вида Sacch. cerevisiae.

При этом культуры дрожжей вида Sacch. carlsbergensis обла­ дают более высокой бродильной энергией и значительно сни­ женной энергией дыхания.

По аналогии наш термофильный вариант дрожжей, наряду

с резко выявившейся недостаточностью в отношении синтеза витамина В6, обладает более высокой энергией брожения и

184

резко сниженной энергией дыхания в сравнении с исходной (мезофильной) формой. Это служит еще одним доказательством

в пользу более глубокой перестройки всего обмена клеток термофильных дрожжей в процессе их приспособления к жиз­ ни при повышенной’ температуре. Такие условия существо­ вания характеризуются большим недостатком в среде кисло­

аэробиза, выработал более стойкие системы для осуществления

анаэробногодыхания. Ослабление деятельностиферментов аэроб­ ного дыхания сопровождалось и резким снижением активно­ сти цитохромоксидазы, а также ферментов, выполняющих син­ тез витамина В6.

Наши экспериментальные исследования наглядно показы­

вают, что как термофилы, выделенные из природы, так и полу­ ченные экспериментальным путем обладают многими сходными свойствами, отличающими их от мезофильных форм.

Заметным отличительным свойством экспериментально полу­ ченной термофильной формы дрожжей является ее способность

развиваться в более широком диапазоне изменений pH среды,

при этом оптимум несколько сдвинут в кислую сторону. Данная работа может иметь практическое значение. Как из­

вестно, на спиртовых заводах, перерабатывающих пищевое сырье, а также древесные гидролизаты и сульфитные щелока, особенно в летнее время, наблюдается повышение температу­ ры при брожении до 35—37°.

Одним из путей улучшения работы таких заводов является применение дрожжей, способных производить сбраживание

углеводов при повышенной температуре (37—38°). В настоя­ щее время в Советском Союзе на некоторых спиртовых за­ водах брожение проводится при повышенной температуре

(36-38°).

С целью выяснения возможности использования термофиль­ ной расы дрожжей в спиртовом производстве были проведены опыты в укрупненно лабораторном масштабе по сбраживанию

ржаных нефильтрованных заторов. Эти опыты дали положи­

тельные результаты.

Показана возможность применения термофильных дрож­ жей и в гидролизно-спиртовой промышленности. Работы в этом направлении продолжаются.

За последние 10—15 лет микробиологи много сделали в об­ ласти изучения тонких взаимосвязей микроорганизмов с внеш­ ней средой как в естественной, так и в экспериментальной обстановке.

В кратком изложении трудно обсудить весь многообразный

фактический материал, касающийся этой весьма интересной

185

ЛИТЕРАТУРА

Андреев А. А. и Луковников Ф. А. 1954. Сбражива­ ние сульфитного щелока при повышенной температуре. Сульфитно­ спиртовый завод Выборгского УБК. «Гидролизная пром-сть СССР», № 3, стр. 11—12.

АристовскаяТ. В. 1948. О ферментативной активности северных рас микроорганизмов. «Микробиология», т. 17, вып. 5, стр. 350—354.

Баширова Р. С. 1958. Активный штамм термофильных молочно­ кислых бактерий для хлебопекарной промышленности. Вопросы пищевой и бродильной микробиологии. Сб. статей (Материалы Со­ вещания по микробиологии пищевой и бродильной пром-сти). Киев, Изд-во АН УССР, стр. 90—94.

БелозерскийА. Н. 1957. О видовой специфичности нуклеиновых кислот у бактерий. Сб. докл. на Международном совещании «Возник­ новение жизни на Земле». М., Изд-во АН СССР, стр. 198—204.

БелозерскийА. И. и Проскуряков И. И. 1951. Прак­ тическое руководство по биохимии растений. М., «Советская наука», 388 стр.

Белозерский А. И. и СпиринА. С. 1956. Современные представления о строении нуклеиновых кислот и их специфичности. «Успехи соврем, биологии», т. 61, № 2, стр. 144—160.

Боярская Б. Г. 1942. О термофильных бактериях, гидролизующих крахмал. «Изв. АН СССР», Отд. биологич. паук, № 1—2, стр. 49—52.

Браше Ж. 1957а. Нуклеиновые кислоты и происхождение белков. Сб. докл. на Международном совещании «Возникновение жизни на Земле». М., Изд-во АН СССР, стр. 207—213.

Браше Ж. 19576. Нуклеиновые кислоты (химия и биология). Сб. статей. Пер. с англ. Под ред. и с предисл. А. II. Белозерского. М., Изд-во иностр, лит., 550 стр.

БроцкаяС. 3. 1945. Термофильные протеолитические бактерии, I. Ослабление протеолитической активности. «Микробиология», т. 14, вып. I, стр. 45—49.

БроцкаяС. 3. 1946а. Термофильные протеолитические бактерии. II. Действие вязких сред на протеолитическую активность бактерий. «Микробиология», т. 15, вып. 1, стр. 13—22.

БроцкаяС. 3. 19466. Термофильные протеолитические бактерии. III. Распространение и методы выделения культур. «Микробиоло­ гия», т. 15, вып. 2, стр. 133—138.

БроцкаяС. 3. 1947. Термофильные протеолитические бактерии. IV. Морфология и физиология. «Микробиология», т. 16, вып. 3, стр. 213—220.

187

БроцкаяС. 3. 1956. Получение активных вариантов плесневых грибов из рода Aspergillus с повышенной протеолитической актив­ ностью. «Микробиология», т. 25, вып. 1, стр. 3—11.

Вяткин В. В. 1954. Условия роста мицелия и накопление амилоли­ тических ферментов при глубинном выращивании гриба Aspergil­ lus niger. Тр. Всес. н.-п. ин-та спирт, пром-сти, вып. 3. М., Пищепромпздат, стр. 34.

Гамалея Н. Ф. 1946. К вопросу об изменчивости микробов. «Агро­ биология», № 3, стр. 115—118.

Гаузе Г. Ф. 1939. Исследования по естественному отбору у простейших. Приспособление Paramecium aurelia к повышению солености среды. Зоол. журн., т. 18, вып. 4, стр. 631—641.

Гаузе Г. Ф. 1947. Проблемы эволюции. Trans. Conn. Acad. Arts Sci., v. 37, p. 17—68.

Гаузе Г. Ф., Кочеткова Г. В. и Владимирова Г. Б. 1957. О биохимических мутантах дрожжевых клеток с поврежденным окислением. «Докл. АН СССР», т. 117, № 1, стр. 138—141.

Генкель П. А. 1946. Устойчивость растений к засухе и пути ее повы­ шения. Тр. Ин-та физиологии растений им. К. А. Тимирязева, т. V, вып. I. М.—Л., Изд-во АН СССР, стр. 3—237.

Голикова С. М. 1926. К вопросу о термобиозе. Журн. микробиол. и инфекц. болезней, т. 3, вып. 1, стр. 79.

Гоффман-Остенгоф О. 1957. Происхождение ферментов. Об. докл. на Международном совещании «Возникновение жизни на Земле». М., Изд-во АН СССР, стр. 126—133.

Грачева Н. П. 1946. Направленная изменчивость кишечной палочки. «Агробиология», № 3, стр. 136—142,

Гребинский С. О. 1941. Витамин С и окислительные ферменты у

Ферментативные процессы в термофильных метантенках. «Вести. Моск, гос. ун-та», № 6, стр. 111—119.

Егорова А. А. 1938. Термофильные бактерии в Арктике. «Докл.

АН СССР», т. 19, № 8, стр. 647—654.

ЕгороваА. А. 1942. Окисление фенолов термофильными микро­ организмами. «Микробиология», т. И, вып. 3, стр. 131—135.

188