книги из ГПНТБ / Логинова Л.Г. Физиология экспериментально полученных термофильных дрожжей

ных гидролизатов при температуре 36—37°. В дальнейшем не­ обходимо было проверить полученные данные в условиях, бо­ лее приближающихся к производственным.

Опыты,1 проведенные методом непре­

рывного брожения. Для брожения была использо­

вана заводская дрожжанка, переоборудованная под бродиль­ ный чан полезной емкости 26 м3. Так как опыты были начаты по­ сле длительного перерыва, то пришлось заново размножать

дрожжи. За период с 6 по 26.VI была накоплена дрожжевая масса в количестве 7—8 г в пересчете на 1 л среды. Дрожжи были в хорошем состоянии. Процент почкующихся клеток коле­ бался от 30 до 15. Количество мертвых клеток не превышало 13% (динамика прироста клеток дрожжей приведена в табл. 52)..

Таблица 52

Динамика накопления термофильных дрожжей при непрерывном притоке свежего сусла и непрерывной сепарации бражки (температура брожения 36°)

*Унос дрожжей через сепаратор.

**Температура брожения 37,5°.

169

Когда было накоплено достаточно дрожжей нашей термо­ фильной культуры, были начаты опыты брожения. Однако в опы­ тах с сепарацией бражки при постоянном притоке све­ жего сусла в чан не удалось достигнуть полного отброда

бражки, так как при данной емкости чана сусло быстро перемешивалось с бражкой и частично уходило с ней на сепаратор.

Последнее обстоятельство не давало возможности учиты­ вать степень отброда бражки, т. е. количество остаточного са­ хара, поэтому дображивание пришлось проводить методом ста­ ционарного брожения.

Полученные данные по выходу спирта при брожении, про­ веденном с термофильными дрожжами при температуре 36°,

соответствовали производственным выходам спирта при темпе­

Однако к концу брожения, когда сахар был полностью из­ расходован, размножение дрожжей проходило замедленно и

несколько возрос процент мертвых клеток. Таким образом, на

когда к моменту сепарации дрожжей всегда оставалось несброженным некоторое количество сахара. Это создавало более бла­ гоприятные условия для состояния клеток дрожжей. Поэтому вопрос о многократном использовании дрожжей в условиях не­

прерывного брожения остался до конца невыясненным.

Сравнительные лабораторные опыты по сбраживанию гид­ ролизного сусла исходной и термофильной расами дрожжей лиш-

170

ний раз убедили нас в том, что выход продуктов брожения у термофильной формы при высокой и обычной температурах

Таблица 55

Сбраживание гидролизного сусла термофильными и заводскими дрожжами (лабораторные опыты. Длительность брожения — 9 час.)

171

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впредставленном кратком изложении трудно дать полную характеристику широко распространенной в природе группы термофильных микроорганизмов. Однако мы пытались показать, что исследования в этой области ведутся с неослабевающим интересом и достигнуты определенные успехи.

Внастоящее время в результате выделения из природы ог­ ромного числа различных новых форм термофильных микроор­ ганизмов и благодаря глубокому изучению их особенностей назрела необходимость в пересмотре существующей их класси­ фикации.

Всамые последние годы получила всеобщее признание тео­ рия о возникновении термофильных форм из мезофильных

путем приспособления последних к высокой температуре. Этот процесс в природной обстановке осуществлялся в ходе дли­ тельной эволюции.

При углубленном изучении обмена веществ у разнообраз­

ных групп термофильных микроорганизмов удалось показать, что отличительной их особенностью является ускоренный ме­ таболизм. Это одна из основных причин приспособленности к жизни при повышенной температуре. Возможно, в связи с интенсификацией всех жизненных процессов, термофилы тре­ буют для своего существования среды, обогащенной пита­ тельными веществами. Однако трудно согласиться с Аллен

(1953) в том, что ускоренный обмен составляет главную при­ чину устойчивости термофилов.

По-видимому, не менее важное значение в сохранении устой­ чивости к повышенной температуре имеет состав белков, жи­ ров и других компонентов протоплазмы клетки. В обстоятель­ ных исследованиях Милитцера и его сотрудников, а также ряда других исследователей показано, например, что многие фер­ менты термофилов обладают большой устойчивостью к

173

высокой температуре (Militzer, Sonderegger, Tuttle a. Georgi, 1949, 1950; Militzer, Tuttle a. Georgi, 1951; Militzer a. Tuttle 1951, 1952; Militzer a. Burns, 1952, 1954; Georgi, Militzer,

Burns a. Heotis, 1951; Georgi, Militzer a. Decker, 1955).

Устойчивость к температуре свойственна не только фермен­ там, но также и цитоплазматическим протеинам клеток термо­ филов (Mallett a. Koffler, 1956; Koffler a. Gale, 1957; Koffler,

1957).

По имеющимся данным, не существует значительных разли­ чий в химическом составе протеинов у термофильных микроор­ ганизмов по сравнению с их мезофильными формами. Однако в настоящее время показано, что протеины термофилов обла­

дают более прочными водородными связями. Наряду с некото­ рыми особенностями в свойствах протеинов отмечены также ко­ личественные различия в содержании некоторых аминокис­ лот в клетках термофилов.

Представляет исключительный интерес работа Уэллерсона

иТетро (1955). Этим исследователям удалось установить у тер­ мофильных микробов при высокой температуре более усилен­ ный синтез рибонуклеиновой кислоты.

По данным Генкокка (Hancock, 1957), оптимальные условия для синтеза протеинов в клетках термофилов соответствуют их оптимальной температуре роста.

Физические свойства клеток, несомненно, также играют оп­

ределенную роль. Так, например, увеличение проницаемости клеток термофилов способствует их ускоренному обмену.

Помимо заметных отличий в свойствах клеток термофилов, которые обеспечивают им возможность существовать при высо­ ких температурах, также немаловажное значение приобретает

исостав среды для их культивирования. Среда, обогащенная белками и углеводами, предохраняет клетки от действия из­

лишне высокой температуры.

Показана возможность закономерного получения термофиль­

ных форм различных микроорганизмов в лабораторной обста­ новке. Это достигается путем адаптации мезофильных форм к постепенно повышаемой температуре.

За последнее время особенно усилились исследования по изу­

чению термофильных дрожжевых организмов. Помимо теорети­

ческого интереса, это диктуется и требованиями практики. Выделение термофильных дрожжей из природных условий

редко удавалось. Это указывает на то, что дрожжи значительно

труднее приспосабливаются к существованию при повышенной температуре по сравнению с бактериями. Пониженный тем­ пературный максимум их развития, а также способность боль­

шинства из них развиваться в довольно широком диапазоне температурных изменений не дают оснований рассматривать

174

эти микроорганизмы как истинные термофилы. Их следует выделить в группу термотолерантных микробов.

Наши исследования были посвящены получению термофиль­

ной формы дрожжей посредством адаптации мезофильной куль­ туры Saccharomyces cerevisiae XII расы к повышенной темпе­

ратуре. Ввиду новизны вопроса и отсутствия опыта работы

в данной области (по адаптации дрожжей к повышенной тем­ пературе) мы были вынуждены одновременно разрабатывать приемы и методы ускоренной адаптации.

Дрожжи являются исключительно удобным объектом для опытов по адаптации к высокой температуре. Наблюдение за характером роста их на плотных средах и микроскопия культу­ ры дают возможность судить о том, как идет их приспособ­ ление.

На первом этапе нас интересовал вопрос: с какой скоростью возникают адаптивные варианты у дрожжей Sacch. cerevisiae под влиянием высокой температуры. Для этого была исполь­ зована методика кратковременного воздействия (в течение 90 мин.) постепенно повышаемой температурой (36—38—40°) на водную суспензию дрожжей в условиях, когда размножение клеток не происходило.

Дрожжи, подвергнутые действию постепенно повышаемой температуры, высевались затем на чашки Петри с сусло-агаром и ставились в термостат при 40°. Через 48 час. размножения вырастало большое число колоний, что бесспорно свидетель­ ствовало о возникновении адаптивных модификаций. После нескольких пассажей адаптированных форм дрожжей при тем­ пературе 40° число выросших на чашках Петри колоний увели­ чивалось. В данном случае происходило дальнейшее при­ способление клеток к повышенной температуре и действовал отбор.

При таком кратковременном воздействии температурой

наблюдались фенотипические изменения и при возвращении дрожжей в обычные условия культивирования вновь приобре­ тенные свойства утрачивались.

Исходная раса дрожжей, не подвергаемая кратковременному температурному воздействию, давала весьма скудный рост на чашках Петри. При дальнейших пассажах в условиях повы­ шенной температуры культура погибала.

Таким образом, нам удалось показать, что путем кратковре­ менной температурной обработки мы можем довольно легко и за короткий срок вызвать фенотипические изменения у дрожжей.

При адаптации к высокой температуре весьма существенным является установление числа пассажей после каждого нового подъема температуры. Так, в ряде случаев после небольшого чис­ ла пассажей при возрастающей температуре удается довольно

175

быстро получить культуру, способную развиваться при тем­ пературе 40 и даже при 42°. Однако при дальнейшем культи­ вировании в новых температурных условиях культура поги­ бает. По-видимому, кратковременное действие высокой темпе­ ратуры микроорганизмы еще могут выдержать, тогда как повторное влияние этой же температуры приводит к «тепловой

.дегенерации», в результате которой культура отмирает. Так, только путем многократных пассажей можно выяснить степень этой приспособленности. Иногда культуру приходится вре­ менно возвращать в прежние температурные условия.

Нами на протяжении ряда лет велась работа по экспери­ ментальному приучению к повышенной температуре культуры дрожжей Sacch. cerevisiae XII расы, используемой в спиртовом производстве.

Проведенные опыты показали полную возможность экс­ периментального получения термофильного варианта дрожжей путем последовательного приучения мезофильной расы к по­ степенно повышаемой температуре. Различные штаммы одной и той же расы с различной скоростью, как нами было показано, приучаются к повышенной температуре. По-видимому, инди­ видуальная изменчивость в данном случае играет известную роль. Поэтому в работе по адаптации микробов к новым факто­ рам среды важно иметь популяцию, полученную из одной клет­ ки.

Экспериментируя с однородной популяцией, мы с большей достоверностью будем убеждены в том, что новые качества, при­ обретенные культурой в процессе адаптации, возникают в ре­

зультате ответной реакции организма на измененные условия среды.

Поскольку при этом процессе клетки подвергаются небла­ гоприятному воздействию в течение довольно длительного вре­ мени и за этот период сменяется большое число поколений, то,

несомненно, здесь совершается и естественный отбор тех вари­ антов, которые наиболее приспособлены к новым условиям су­ ществования.

Как известно, в опытах по адаптации также необходимо учи­

176

ной и той же температуре. В некоторых случаях, когда наблю­

далось ухудшение состояния дрожжей, приходилось несколь­ ко пассажей проводить при более низкой температуре, а затем

на основании наблюдений под микроскопом, но и по внешнему виду дрожжей. Побурение осадка свидетельствовало о небла­

гоприятном влиянии повышаемой температуры.

При экспериментальном получении термофилов из мезофиль­ ных форм большинство исследователей и ранее применяло ме­ тод культивирования микробов при постепенно повышаемой температуре. Однако в этих опытах, как и при однократном воз­ действии на микроорганизмы высокой температурой, не всегда

удавалось достичь положительных результатов.

Изучая адаптацию дрожжей к повышенной температуре, мы стремились выяснить те оптимальные условия, при которых этот процесс проходил бы наиболее успешно.

По сведениям, имеющимся в литературе, количество посев­ ного материала в сильной степени влияет на адаптацию к вы­ сокой температуре. Мы решили проверить, существует ли эта

зависимость. В многочисленной популяции, как можно было

предполагать, создается возможность для возникновения боль­ шего количества клеток с новыми свойствами. Это обеспечит

селекцию вариантов, наиболее приспособленных к данным усло­ виям жизни микроорганизма.

В этой связи было интересно установить, в какой степени на процесс изменчивости и селекцию адаптированных форм

может влиять различный объем питательной среды, если сохра­ няется соотношение между количеством выросших посевных клеток и объемом.

Как было показано, большие объемы питательной среды ока­

зывают положительное влияние на клетки при длительном куль­ тивировании микроорганизма в неблагоприятных условиях. Эти данные нами были учтены при проведении опытов.

Значительную роль в процессе адаптации к температурному фактору играет не только количество внесенного посевного ма­ териала, но и возраст культуры, состав питательной среды и ряд других факторов. При проведении опытов по адаптации мы пользовались большим количеством посевного материала, по преимуществу использовали культуру более молодого воз­ раста и культивирование проводили на полноценной в отноше­ нии питания среде.

В лабораторных опытах большею частью применялась ес­ тественная питательная среда — жидкое солодовое сусло,

которое было близко и к производственным средам (заторы из пищевого сырья).

Приучение дрожжей к повышенной температуре означает фактически приспособление их к целому комплексу новых усло­

вий, возникающих в среде под воздействием нового фактора.

Одним из них следует назвать пониженное содержание кислоро­ да, так как его растворимость в субстрате при высокой темпе­ ратуре значительно снижается.

Действуя на клетки постепенно повышаемой температурой, мы, по-видимому, влияем на наследственную основу организма.

В результате такого воздействия клетки, становясь более лабиль­ ными, довольно быстро приспосабливаются к сложному комп­

лексу новых условий, возникающих в среде под воздействием

температурного фактора. При этом дрожжи претерпевают глубокие физиологические изменения, в результате чего суще­

ственно изменяется у них обмен веществ и весь процесс их развития.

В опытах было показано, что исходная раса дрожжей, по­ мещенная в необычные для нее температурные условия (40°),

значительно снижает свой темп размножения. Клетки при этом принимают необычную форму и уже ко вторым суткам культи­ вирования в большом количестве погибают. Однако бродиль­ ная энергия у исходной формы в этих условиях культивиро­ вания еще довольно высока. Дальнейшие пассажи при высоких температурах приводят к массовой гибели культуры.

В результате длительного (18 месяцев) культивирования дрожжей на солодовом сусле нами была получена культура,

способная развиваться при температуре 40° (вариант Т2).

В дальнейшем нам довольно легко удалось приучить эту форму постоянно развиваться на высококонцентрированном

солодовом сусле. Для этого потребовалось три месяца, в тече­ ние которых проводилось культивирование термофильного

варианта Т2 на солодовом сусле с постепенно повышаемой концентрацией сахара (12—14—16° Бал.).

Полученный вариант Т3, приспособленный к жизни на среде с высоким содержанием сахара, обладал вместе с тем высокой бродильной активностью. Группа осмофильных дрожжей в при­ роде, как известно, широко распространена. Эти дрожжи спо­

собны переносить концентрации сахара в среде, доходящие до 80% (Имшенецкий, 1936). Также известно, что дрожжи доволь­ но легко приспосабливаются к сбраживанию повышенных кон­ центраций сахара. Так, например, Комаровой (1951) удалось

адаптировать культуру дрожжей Sacch. cerevisiae расу «Я» к брожению на мелассе с высокой концентрацией сахара (до

30%).

Полученные нами термофильные варианты дрожжей отли­ чались от исходной расы рядом морфологических, физиологи­ ческих и биохимических особенностей. Вновь приобретенные

178