Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

книги из ГПНТБ / Тарусов Б.Н. Сверхслабое свечение биологических систем

.pdf
Скачиваний:
50
Добавлен:
29.10.2023
Размер:
3.46 Mб
Скачать

Т а б л и ц а 7

Хемилюминесценция биолипидов, извлеченных из различных органов человека (имп/Ю сек)

Объект

 

 

Температура,

°С

 

исследо­

20

30

40

50

60

70

вания

Мозг . . . 48—58

100-130

170-190

400—430

800—890

21002600

Сердце . . 67—91 130—160 300—430 550—570

1540-1750

Печень . . 36-51

49—74

80-120 120—160

210—270

570-68

Почки . . . 63—83 120-150 270—300 430—460

990-1190

Олеиновая

27-35

45-60

76—85

120-160

230-280

 

кислота .

 

Некоторыми исследователями высказывалось предположе­

ние,

что сверхслабое излучение в биологических

системах

7

имп

может

 

возникать

при

раз­

ложении перекиси

водорода

 

мин

 

 

каталазой.

Г.

А.

Попов и

 

 

Б. Н. Тарусов (1963) обна­

 

 

ружили, что добавление пе­

 

 

рекиси

водорода

к свежим

 

 

гомогенатам

различных

ор­

 

 

ганов

животных

вызывает

 

 

сверхслабую

 

хемилюминес­

 

 

ценцию (рис. 11).

Они

на­

 

 

блюдали чрезвычайно

 

сла­

 

 

бое излучение, которое вряд

 

 

ли можно отнести за счет

 

 

разложения

перекиси

водо­

 

 

рода, так как повышение

Рис. 11. Хемилюминесценция гомоге­

концентрации

перекиси

во­

ната печени крысы при добавлении

дорода до довольно значи­

 

перекиси водорода:

тельных

цифр

не вызывало

1 — без обработки; 2 — после дена­

никаких

изменений.

В

то

 

турации; 3 — фон.

же время разложение пере­

 

 

киси

водорода происходит

 

 

очень энергично.

 

 

 

При прибавлении перекиси к кратковременно нагретому до 100° С гомогенату, в котором произошла денатурация бел­ ка и разрушение липопротеиновых комплексов, возникает до­ вольно значительная хемилюминесценция. Она растет про­ порционально концентрации перекиси водорода и превышает фон в 40—50 раз. В то же время интенсивность разложения перекиси водорода идет с гораздо меньшей скоростью, неже­ ли в неденатурированном гомогенате. Однако эта хемилюми-

30

несценция не является результатом непосредственного распа­ да перекиси водорода. Оказалось, что в данном случае она связана с присутствием кислорода и при откачивании возду­ ха приостанавливается.

Эти опыты показывают, почему реакции нормального окисления в тканях, связанные с ферментативными превра­ щениями, не дают излучений. В ферментативных реакциях превращения осуществляются на более низких энергетиче­ ских уровнях, и вероятность появления возбужденных со­ стояний, обладающих таким запасом энергии, при котором они могли бы испустить квант в видимой части спектра, очень мала. При разрушении ферментной системы реакция распада перекисей требует более высокой энергии актива­ ции, поэтому эта вероятность повышается.

Таким образом, распад перекиси водорода в живых клет­ ках не может служить источником излучения. В то же время показано, что так же, как и другие перекиси, перекись во­ дорода активирует и усиливает хемилюминесценцию липи­ дов, хотя она и нерастворима в липидной фазе. Эта актива­ ция происходит на границе фазы липид-вода. Если на по­ верхность олеиновой кислоты налить перекись водорода, то интенсивность хемолюминесценции начнет постепенно на­ растать. Активация и образование липоперекисных радика­ лов возникает на поверхности и распространяется в’ глубину липидной фазы.

IV. РОЛЬ АНТИОКИСЛИТЕЛЕЙ В СВЕРХСЛАБОМ СВЕЧЕНИИ

Тот факт, что реакция окисления, с которой связана хе­ молюминесценция, протекает очень слабо и с большим по­ стоянством, говорит о том, что в ней участвуют ингибиторы, не позволяющие этой реакции развиваться с самоускорением и достигнуть большой интенсивности. Такими ингибиторами служат антиокислители, которые перехватывают радикалы и снимают их активность или, как сейчас принято говорить, пе­ реводят активные радикалы в малоактивные.

О том, что антиоксиданты имеют большое значение для консервации запасенных жиров в клетках покоющихся семян, было известно уже давно. Исследователями было предложе­ но использовать некоторые природные продукты для защи­ ты от окисления жиров. Основная роль антиоксидантов за ­ ключается в защите важных липидных структур от разруше­ ния и стабилизации липо-протеинового комплекса, из кото­ рого построены различные органоиды клеток. Для поддержа­ ния этого комплекса основное значение имеет группа липи­ дов-токоферолов, обладающих антиоксидативными свойства­ ми, к которым относится витамин Е. По каким-то, пока не-

31

выясненным, причинам высокое содержание этих антиокси­ дантов, т. е. полное ингибирование реакций, вредно для су­ ществования клетки и необходимо некоторое равновесие между количеством естественных антиоксидантов и количе­ ством окисляющихся липидов. Сейчас выдвигается гипотеза о том, что функциональная целостность липидных структур клеток поддерживается двумя факторами: равновесием между антиоксидантами-токоферолами и анти-антиоксидантом, раз­ рушающим токоферолы — витамином А, который также пред­ ставляет собой липид. Всякое нарушение этого равновесия влечет за собой нарушения функций клеток.

Так как сверхслабое излучение отражает кинетические за­ кономерности протекания окислительных процессов в липи­ дах, регулируемые антиоксидантами, то встает вопрос — в какой мере при помощи измерения кинетических параметров реакции по сверхслабому свечению можно получить инфор­ мацию о состоянии системы антиоксидантов и нарушениях, там происходящих.

Физико-химические работы по анализу кинетики окисли­ тельных реакций в присутствии антиокислителей показали, что при определенных соотношениях окисляющегося вещества и антиокислителя цепная реакция будет медленно развиваться по закону самоускорения А * с постоянной скоростью, при которой концентрация всех продуктов, участвующих в реак­ ции, должна оставаться постоянной. В условиях же стационар­ ного режима антиокислитель постоянно расходуется, так как в каждом акте взаимодействия молекулы антиокислителя с радикалом происходит гибель и того и другого. В результа­ те реакции концентрация антиокислителя падает. Когда она снизится до критического порога, реакция сразу же перехо­ дит в нестационарный режим и начинает автоускоряться; это уже будет переход от нормы к патологии. Эти изменения скорости расходования антиоксиданта в зависимости от усло­ вий протекания реакции изучались химической кинетикой. На многочисленных примерах было показано, что реакция в мас­

лах, ингибированная фенилбетанафтилом,

оксифениламином

и некоторыми другими, позволяет долго

хранить продукт,

однако после израсходования ингибитора начинается его бы­ строе разрушение.

Для длительного поддержания стационарного состояния необходимо, чтобы концентрация основных продуктов постоян­ но возобновлялась. Как известно, в животном организме антиоксиданты не синтезируются. С точки зрения термодина­ мики подобная система является открытой. В открытых си­ стемах должны существовать непрерывные компенсирующие потоки и только при их существовании возможно равновесие.

Основным условием постоянства протекания реакции слу-

32

жит известное уравнение Пригожина:

----at

1----

-- — ; где а

 

 

at dt

поток распада, b — поток поступления вещества. Равновесие сохраняется только при равенстве потоков расхода антиокси­ дантов и поступления их извне. Естественно, что расход антиоксиданта, т. е. величина потока, будет зависеть от ско­ рости реакции, которая развивается при данном стационар­ ном равновесии. Чем выше скорость, тем больше должны быть потоки; наконец, наступает критическая величина рас­ ходования, которая уже не сможет компенсироваться прито­ ком. Содержание антиоксидантов в системе будет характери­ зовать возможности системы поддерживать стационарное со­ стояние, т. е. нормальное функционирование.

Для учета баланса антиоксидантов была сделана попыт­ ка оценивать суммарную антиоксидативную активность кле­ точных липидов с помощью сверхслабого свечения. Для этой цели была использована олеиновая кислота, окисляющаяся в присутствии воздуха. Реакция развивается в олеиновой кисло­ те по кинетике цепных разветвленных реакций, и в ходе ее возникают перекиси и перекисные радикалы:

R -+ 0 2^ ROO-, ROO- + R H - * ROOH + R-.

При введении антиоксидантов в эту окисляющуюся систе­ му через некоторое время реакция замедляется вследствие того, что антиоксидант, реагируя с радикалами или перекися­ ми, уменьшает их концентрацию:

R -+ А -> RH + А-

R ОО- + АН -+ R ООН + А-,

что отмечается по уменьшению интенсивности сверхслабого излучения олеиновой кислоты.

Это постоянно наблюдалось при действии таких ингиби­ торов окисления, как цистеин, бетамеркаптоэтиламина, тиомочевины и т. д. Замедление объясняется тем, что образовавший­ ся здесь радикал А■ менее активен, нежели перекисный, и не способен продолжать цепь. Нам во время прохождения реакции удалось обнаружить эффект несколько аномально­ го характера. Через короткий промежуток времени при до­ бавлении порции раствора антиокислителя начинается зна­ чительное усиление хемилюминесценции — «вспышка», про­ должающаяся от 10 до 30 мин при температуре около 50° С; затем начинается снижение свечения и уменьшение скорости окисления. Эта вспышка с различным временным течением наблюдалась при введении в окисляющуюся олеиновую кис­ лоту или окисляющиеся жиры животного и растительного происхождения различных ингибиторов окисления — цистеи­ на, меркаптоэтиламина, некоторых антибиотиков, не содер­ жащих серу, аминов и т. д.

3 Сверхслабое свечение

33

При изучении реакции было установлено, что максималь­ ный выход хемилюминесценции наблюдается тогда, когда при реакции окисления имеется максимальное накопление пере­ кисей и перекисных радикалов (Тхор, 1965). Эти работы не­ сколько дополняют наши представления о механизме сверх­ слабого свечения биологических систем. Полученные данные говорят о том, что при наличии в липидах антиоксидантов, некоторая часть высвечивания приходится и на их долю. При­ ходится допустить, что при взаимодействии антиоксиданта с радикалами в окисляющемся субстрате происходит в пер­ вом приближении взаимодействие такого характера:

/? •+ АН - RH + Л « - * Я / / + А + Ь

ROO-+ АН -> R ООН + A *-* R ООН + А + ftv

Более глубокий анализ и сопоставление временных пара­ метров прохождения вспышки при действии антиоксидантов с химическим определением перекисного числа показали, что при возникновении вспышки и во время ее развития перекисное число не меняется, а падение количества перекисей на­ чинается позже. Это говорит о том, что излучательное взаи­ модействие происходит, вероятно, с радикалами типа R. Та­ кого же рода исследование проведено с липидными экстрак­ тами из тканей печени животных; было обнаружено, что эти экстракты (как спиртовые, так и эфирные) при прибавлении к окисляющейся олеиновой кислоте дают также вспышку та­ кого же временного характера.

При вспышке, которая происходила при прибавлении эфирного экстракта, мы наблюдали ту же картину, которая характерна для реакции с цистеином, бетамеркаптоэтиламином. Антиоксиданты эфирной вытяжки в данном случае инги­ бируют развитие окислительной реакции в олеиновой кисло­ те, реагируя с радикалами R'. При прибавлении к олеиновой кислоте спиртовой вытяжки из того же органа также наблю­ дается вспышка, которая развивается в несколько укорочен­ ные сроки, но при этом одновременно происходит падение перекисного числа.

Подобные факты говорят о том, что природа антиоксидан­ тов, извлекаемых из липидов эфиром и спиртом, несколько различна. При эфирной экстракции извлекаются ингибиторы радикального типа, при спиртовой вытяжки — ингибиторы перекисей. Необходимо учитывать, что при экстракции эфи­ ром извлекаются свободные липиды тканей, а при экстракции спиртом — связанные липиды, из которых построены липо­ протеиновые комплексы. Эти исследования позволяют сделать вывод, что антиоксиданты, извлекаемые экстракцией из тка­ невых липидов, могут быть обнаружены по эффекту вспыш­ ки.

1 А* — радикал в возбужденном состоянии.

34

В подкрепление этого положения можно еще отметить,

что явление вспышки

было обнаружено

не только

in vitro

А. Ш. Агавердиев. Б.

Н. Тарусов (1965),

прибавляя

к пита­

тельной жидкости корней пшеницы и ячменя антиоксиданты, содержащие серу, установил, что наблюдаемое сверхслабое излучение корней на некоторый промежуток времени усили­ вается и только после этого происходит эффект торможения излучения.

Это дало основание для того, чтобы применить эффект вспышки для обнаружения антиоксидантов в тканях живот­ ных и растений. С помощью такого метода произведено изу­ чение содержания антиоксидантов в различных органах жи­ вотных и изменение их при патологиях и изменении физиоло­ гических условий. Так, в работе А. И. Джофарова (1965) изучалось изменение интенсивности сверхслабого свечения при действии температуры на животные ткани (мышцы, пе­ чень, кожа). При этом были обнаружены в основном те же закономерности, как и при изменении температуры у расте­ ний (табл. 8).

Здесь при снижении температуры интенсивность свечения также снижалась, и практически ее нельзя было заметить уже при температуре 10° С. Далее при понижении темпера­ туры вплоть за замораживания свечение не появлялось. Вспышка закономерно возникала при оттаивании мышцы при

плюсовой

температуре

3—6° С,

дальнейшее же

повышение

 

 

 

 

 

 

 

 

Т а б л и ц а 8

Изменения

интенсивности

сверхслабого

свечения

мышц

белых

крыс

в

зависимости от

изменения температуры

(ам п/м ин)

 

 

 

 

 

 

Температура, ° С

 

Объект исследования

 

25

20

15

10

5

0

фон

 

 

 

Охлаждение

мышцы от 25°

900

590

280

90

90

90

80-110

до — Ю °С ...............................

Оттаивание той же мышцы .

1570

920

540

100

320

100

 

Оттаивание мышцы с глице­

980

600

310

140

170

100

 

рином .......................................

 

Оттаивание мышцы с цисте-

200

150

120

100

100

100

 

амином ...................................

 

температуры приводило к более интенсивному возрастанию свечения, чем при снижении ее.

У мышц, обработанных глицерином по рецептуре, при­ меняемой при консервировании тканей, предназначенных для пересадки, интенсивность низкотемпературной вспышки при оттаивании значительно ниже, и кривая изменения свечения

3*

35

при обратном ходе почти совпадает с кривой, полученной при снижении температуры. При обработке ткани цистеамином, являющимся, как известно, ингибитором окислительных реак­ ций, свечение почти полностью гасится.

т Ufitn

J сен

Эти наблюдения дают ин­ формацию о том, что разру­ шение структуры липопротеи­ нов в мышечной ткани проис­ ходит не при замораживании, как у растений, а при обрат­ ном оттаивании. И как у рас­ тений, вспышка, наблюдаю­ щаяся при низких температу­ рах, обусловлена окислитель­ ными реакциями.

 

 

 

 

В работах ряда исследова­

 

 

 

 

телей (Бурдин, Пархоменко,

 

 

 

Тмин

Петрусевич,

1964)

использо­

 

 

 

вался эффект тушения сверх­

 

 

 

 

Рис.

12.

Хемилюминесценция

слабого излучения тирозина в

липидов

из

соединительной

электрохимической

ячейке, что

 

 

ткани

рыб:

позволило количественно

диф­

1 — горбуша; 2 — кета; 3

ференцировать

защитную

ан-

нерка; 4 — карп; 5 — конт­

тиоксидативную

 

мощность

роль

(олеиновая

кислота); / —

 

интенсивность

хемилюминес­

препаратов

профилактическо­

ценции; Т — время

го действия

и

дифференциро­

 

 

 

 

вать

радикальные

ингибиторы

При

 

 

 

от иероксидных (рис. 13).

действии повреждающих

агентов,

например

ио­

низирующих излучений, происходящее усиление свечения сопровождается повышением расхода антиоксидантов, по­ следнее увеличивается также при росте и клеточном де­ лении.

На этом основании А. И. Журавлевым и В. П. Корженко (1963) была выдвинута концепция, что у тех животных, у ко­ торых происходит интенсивный рост и деление клеток, долж­ но быть повышенное содержание антиоксидантов в липидах. Интенсивность роста, согласно этому предположению, может повышаться только тогда, когда есть запас антиоксидантов, который может компенсировать их повышенный расход. Это вполне логично с точки зрения термодинамики открытых си­ стем. В любых физиологических условиях клетка будет функ­ ционировать нормально, если реакции в ней будут развивать­ ся стационарно. Способность клеток приспосабливаться к экстермальным условиям зависит от того, в какой мере и в каких пределах она сможет переходить на другие стационар­ ные уровни, особенно на высшие, когда стационарный уро­

36

вень осуществляется на повышенных скоростях реакций. При повышенном росте скорости реакций возрастают, и возмож­ ность осуществления данного уровня связывается и ограни­ чивается той предельной скоростью, на которой организм сможет удержать стационарность. Присутствие большого ко­ личества антиоксидантов, естественно, расширяет пределы авторегулирования и позволяет выше поднять скорость реак­ ций, не нарушая стационарности.

Действительно, А. И. Журавлев и В. П. Корженков, на основании изучения хемилюминесценции по вспышке у рыб с различной скоростью роста — горбуши, кеты, нерки, карпа, установили, что скорость роста явно коррелирует с содержа­ нием антиоксидантов в тканевых липидах (рис. 12).

Интересные исследования были проделаны Ю. М. Петрусевичем и Ю. П. Козловым, изучившим хемилюминесцентным методом расход антиоксидантов при изменении осмотических условий у морских организмов. Ими установлено, что при по­ нижении осмотического давления в яйцах морского ежа про­ исходит повышенный расход и снижение количества антиок­ сидантов, в результате израсходования антиоксидантов происходит гибель животных. Морские ежи, как известно, относятся к организмам, плохо переносящим опреснение морской воды. У формы более устойчивой к опреснению — актинии (Actinia equina), процент израсходования антиокси­ дантов протекал при изменении осмотического давления медленнее. Сравнительное исследование организмов с различ­ ной способностью выдерживать опреснение и переходить из моря в реки показало, что у организмов, способных осуще­ ствлять такой переход, антиоксидативный индекс значитель­ но выше.

На важность антиоксидантов в поддержании стационарно­ го окисления и защите липидных структур от окисления ука­ зывает и исследование И. И. Иванова, Ю. М. Петрусевича (1965), в котором при изучении вспышки хемилюминесценции в олеиновой кислоте было установлено, что в плазме крови животных существует некоторое постоянное количество ан­ тиоксидантов. Это говорит о том, что в норме в организме существует постоянный поток антиоксидантов, поставляющий их в клетки. Во всяком случае уже сейчас можно оказать, что сверхслабое свечение связано с окислительной реакцией в липидах, стационарный уровень которой регулируется ан­ тиоксидантами. Поэтому сверхслабое излучение и методы, построенные на его использовании для оценки радикальных процессов, могут дать очень ценную информацию о состоя­ нии антиоксидативной системы тогда, когда применение не­ посредственных химических методов невозможно.

37

2 8 r

24

20

16

12

 

 

 

 

 

8

I I

 

 

 

 

4

V \ya

 

 

 

 

 

 

 

 

7

1 1

 

ул

m и .

V7 7Л a

Ф В lT B*T Ф M T

M+T

Ф 3 T Т+Э

Ф АЭТ тA3T+T

j./ 0 3 urn

гек

28

24V

20

16

 

 

И

7,

l l

 

 

 

12

 

 

 

 

/I

у

 

 

 

 

 

У

у

8

 

 

 

 

I

 

 

 

 

 

 

 

4

 

 

 

i

М

0

IZL A

J2L

A SA

Ш S3.

 

 

 

Ф П Г Г О М

<Р Г Т Г+Т Р В О т В П *Т Ф П Т 0 *7

Рис. 13. Ингибиторы хемилюминесценции

и_ вещества,

обладаю­

 

щие

радиационно-защитным

действием:

 

 

В — веронал 5 мг/мл; М — мединал 5 мг/мл; Э — эвипол 2,5 мг/мл; АЭТ — а-аминоизотиуроний 40 мг/мл; П — пропилгаллат 12 мг/мл; г — грамицидин 100 мг/мл; в — винилпиралидон 1%; Я — пиридин 0,005%; Ф — фон, Т — тирозин

V. СВЕРХСЛАБАЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ РАСТЕНИИ

В 1955 г., использовав высокочувствительный фотоумножи­ тель с охлаждением, Л. Коли и его сотрудники (Colli et al. 1955) обнаружили сверхслабое свечение корешков растений. Однако они не изучили природу этого свечения. Применив весьма чувствительную методику для измерения сверхслабых световых потоков, наши советские исследователи показали, что это излучение действительно существует и испускается корневыми волосками всех растений.

Анализ механизма этого излучения в основном проводил­ ся на корнях злаковых растений (пшеницы, ячменя различных сортов). Для этой цели семена в течение нескольких дней в оптимальных условиях температуры проращивались в кри­ сталлизаторе с определенной поверхностью до тех пор, пока корни не образовывали сплошной массы и заполняли всю по­ верхность. Затем сосуд с корнями помещали в специальную влажную камеру, в которой можно было регулировать темпе­ ратуру в пределах от —8 до 50° С. Через камеру постоянно пропускался воздух или газовые смеси, в которых содержание кислорода и углекислоты колебалось от 1 до 98%. Кроме то­ го, с помощью электротермометров (термисторов) регистри­ ровалась непосредственно температура корней.

С помощью камеры с прозрачной передней стенкой, кото­ рая располагалась против фотокатода фотоумножителя, была показана возможность достоверной регистрации сверхслабо­ го излучения с поверхности 10 см2 даже при температурах, близких к пулевым. При повышении температуры излучение усиливалось и, например, при 16— 18° С, измеряемое с по­ мощью современного фотоумножителя ФЭУ-42 оно превы­ шало фон в 5—6 раз (Веселовский, 1965).

Изучение спектра излучения корней растений, проведен­ ное с помощью светофильтров, показало, что оно (как и у животных тканей) лежит в широкой области видимого спект­ ра, не распространяясь в область ультрафиолета. Было обна­ ружено, что интенсивность свечения зависит от парциального давления кислорода. Однако отмеченная зависимость нели­ нейна — сильное снижение интенсивности свечения происхо­ дило тогда, когда парциальное давление кислорода снижа­ лось до 0,5% и ниже; в интервале же от 30— 100% интенсив­ ность свечения практически не зависела от концентрации кислорода.

Эта своеобразная зависимость скорости реакции от содер­ жания кислорода, когда наблюдается пороговая зависимость, очень напоминает аномальную зависимость скорости реакции от давления кислорода, характерную для цепных вырожден­ но-разветвленных реакций, реакций окисления в липидах.

39

Соседние файлы в папке книги из ГПНТБ