книги из ГПНТБ / Лясковская Ю.Н. Методы исследования окислительной порчи жиров

растворителю, применявшемуся для экстракции жира. Для слепого опыта в оценке перекисей берут раствор, содержащий 8 мл смеси

«бензол-метанол», 1 мл каждого реактива и 1 каплю пирофосфор-

ной кислоты (реактив 7). Слепой опыт будет иметь , пик окраски, указывающий достаточный излишек дихлорфенолиндофенола. Этот реактив лучше готовить незадолго перед употреблением, так как

FeCl2 окисляется в органических растворителях значительно ско­ рее, чем в водном растворе.

4. Раствор роданистого аммония. 30 г роданистого аммония

растворяют в воде до объема 100 мл.

5.Около 0,04 г 2,6-дихлорфенолиндофенола растворяют в 10 мл метанола и доводят до 100 мл бензолом. Раствор остается устой­ чивым в течение нескольких месяцев.

6.Раствор FeSO« • 7Н?О. Для стандартизации дихлорфенолин­

дихлорфенолиндофенола, дает результаты, подобные полученным

сраствором FeCl2 известной концентрации).

7.Раствор пирофосфорной кислоты. 10 г Н4Р2О7 растворяют в

100 мл метанола.

Стандартизация дихлорфенолиндофенола. Водный раствор

FeSO4-7H2O (5 мл реактива 6) разводят метанолом, взятым

ную колбу) прибавляют 1 мл раствора дихлорфенолиндофенола и смесь доводят до 10 мл бензолом. Слепой опыт готовится из 2 мл разведенного раствора FeSO4 -7Н2О в метаноле, 1 мл раствора ди­ хлорфенолиндофенола, 0,9 мл метанола и 1 капли раствора пиро­ фосфорной кислоты; все это доводится до 10 мл бензолом. Из коло­ риметрического отсчета коэффициент экстинкции может быть

зависимости от концентрации красящих веществ, тогда как от­ ношение между спектро-фотометрическими отсчетами и концентра­

цией красящего вещества, как правило, является линейным. В же­ лезороданидном методе коэффициент экстинкции, соответствую­ щий 55,84 р г Fe’", был найден равным 1,436 при 510 ммк.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ОКИСЛЕНИЯ С 2-ТИОБАРБИТУРОВОЙ КИСЛОТОЙ

Методы определения степени окисленности жиров по реакции с тиобарбитуровой кислотой получили довольно широкое распрост­ ранение.

По литературным данным, они дают хорошее совпадение

с органолептическим определением прогорклости.

HN — СО

I I

SC сн2

I I

HN - СО

2-тиобарбитуровая кислота

(малонилтиомочевина)

Установлено, что тканевые суспензии или срезы при аэробной инкубации образуют соединения, которые конденсируются с р-аминобензойной кислотой с образованием желтой окраски, или с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием оранжево-красной окраски. Наиболее интенсивная реакция получилась с препаратами мозга, а затем печени [57].

Бернгейм и др. [24] применили реакцию с тиобарбитуровой кислотой для наблюдения за образованием продуктов окисления

ненасыщенных жирных кислот. Они установили, что при реакции

инкубируемой ткани с тиобарбитуровой или р-аминобензойной кислотой окраска образуется продуктами окисления ненасыщенных

•жирных кислот. Кроме того установлено, что после инкубации чистая линолевая кислота при реакции с тиобарбитуровой кисло­ той дает только следы окраски. При тех же условиях метиллиноленат образует интенсивную окраску. Спектры поглощения раство­ ров 2-тиобарбитуровой кислоты с некоторыми фосфатидами и жир­ ными кислотами были идентичны со спектрами, полученными ранее другими авторами [57].

2-тиобарбитуровая кислота была применена также II 10J в ка­ честве реактива, обнаруживающего окисление ненасыщенных жир­ ных кислот, обусловленное воздействием различных факторов. Авторы показали, что при некатализируемом и катализируемом

окислении ненасыщенных жирных кислот образуются неизвест­

ные соединения, которые при нагревании с тиобарбитуровой кис­ лотой в растворе трихлоруксусной кислоты дают оранжево-крас­ ное окрашивание. Реакция очень чувствительна.

Паттон и Керц [72], изучая реакцию с тиобарбитуровой кисло

той, нашли, что малоновый диальдегид дает очень сильную реак­ цию с тиобарбитуровой кислотой и эта реакция помогает обнару­ живать начинающееся окисление. Реакция гораздо чувствительнее реакции Крейса и дает измеримые результаты тогда, когда еще нельзя органолептически обнаружить признаков прогоркания. Реакцию с тиобарбитуровой кислотой они применили для обнару­ жения окисления в жире молока.

. . . При сравнении методов определения продуктов окисления жир­ ных жислот, образовавшихся под действием ультрафиолетового облучения, Кенастон, Вильбур и др. [54] большое внимание уде­

■ 22

на спектрофотометре Бекмана модели DH. Результаты определения выражали в оптической плотности.

Биге и Брайант [25] модифицировали метод Данкли и Джен­ нингса [361 с 2-тиобарбитуровой кислотой для определения окис­ лительной порчи жиров в коровьем масле, сухом молоке, сыре и других молочных продуктах. Этот метод в их модификации не требует выделения жира. Навеску продукта обрабатывают 0,025 молярным раствором 2-тиобарбитуровой кислоты в молярном растворе фосфорной кислоты в течение часа. Обработка произво­ дится в атмосфере азота в 3-горловой колбе емкостью 300 мл, снабженной мешалкой с ртутным затвором. К 10 мл жидкости до­ бавляют 10 мл смеси изоамилового спирта и пиридина (2:1), охлаждают, центрифугируют и измеряют поглощение с помощью

спектрофотометра (при длине волны 535 мяк). Добавление к ра­ створу 2-тиобарбитуровой кислоты эмульгатора (10-процентный раствор хлористого алкилдиметилбензоламмония в отношении

14: 1) ускоряет реакцию. Органолептическая оценка сухого моло­ ка совпадает с этой пробой.

Сидуэлл, Салуин, Бенка и Митчел 1921 для определения степени

окисления жиров применили 2-тиобарбитуровую кислоту, дающую цветную реакцию с продуктами окисления жира. Исследование жиров, длительно хранившихся при различных температурах (от—29 до +38°). а также искусственно окисленных жиров

(ускоренное окисление путем аэрирования при высокой темпера­

туре и ультрафиолетовом облучении) показало, что метод вполне пригоден для изучения процесса окисления.

Цветная реакция с окисленным соевым маслом получается более интенсивной, чем со свиным жиром и хлопковым маслом при равных перекисных числах.

Реакция с 2-тиобарбитуровой кислотой наиболее интенсивно протекает при растворении жира в бензоле или четыреххлористом

углероде, встряхивании с 2-тиобарбитуровой кислотой, отделении водного слоя, нагревании в течение 30 мин. и измерении поглоще­ ния при длине волны 530 ммк.

Метод дает хорошие результаты при определении прогорклости лярда, соевого, коровьего и хлопкового масел.

Применение [105] метода с 2-тиобарбитуровой кислотой для

определения степени прогорклости лярда показало, что этот метод согласуется с перекисным числом и органолептикой.

Тёрнер и др. 1104] применяли 2-тиобарбитуровую кислоту в качестве реагента для измерения . прогорклости в мороженой свинине. Результаты сопоставления реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой и определением перекисных чисел приведены в табл. 7.

Они установили, что реакция с 2'-тиобарбитуровой кислотой обеспечивает большую надежность определения прогорклости, чем другие химические методы.

Установлено, что сахара и некоторые продукты копчения дают

красную реакцию с 2-тиобарбитуровой кислотой. Поэтому для

24

соленого и копченого мяса неооходима поправка на содержание

Было показано 121], что реакция с 2-тиобарбитуровой кислотой

позволяет обнаружить неприятный маслянистый и рыбный запах в беконе в соответствии с органолептической оценкой.

Метод с 2-тиобарбитуровой кислотой был модифицирован и

применен Ю и Синхыобером [1111 для измерения прогорклости рыбных продуктов и дал положительные результаты. Позже эти же авторы [93], основываясь на том, что малоновый альдегид дает с 2-тиобарбитуровой кислотой типичную красную окраску, предло­ жили метод количественного измерения прогорклости рыбных продуктов, в котором степень окислительного прогоркания выра­ жается в миллиграммах малонового альдегида на 1000 г образца.

В качестве стандарта для определения используется 1, 1, 3, 3-тет- раэтоксипропан,

ОС2Н5 ОС,Н5

I I

сн-сн2 — сн

I I

ОС2Н5 ос,н5,

кислотный гидролиз которого приводит к образованию малоно­ вого альдегида, количественно реагирующего с 2-тиобарбитуровой кислотой и, следовательно, позволяющего определить карбониль­ ные соединения, спектр поглощения которых сходен с таковым

окисленной муки и неочищенной рыбы (рис. 1).

Метод определения окисленности с 2-тиобарбитуровой кисло­ той дает также возможность наблюдать ингибированное окисле­ ние. Следовательно, антиокислители не мешают протеканию реакции.

Метод был применен [29] к зерновым и печеным продуктам. Для удаления побочных продуктов реакции была применена

хроматографическая колонка, заполненная порошком целлюлозы.

25

Очистка была необходима, так как присутствие сахаров нарушало

реакцию 2-тиобарбитуровой кислоты с продуктами окислительной порчи жира.

Рис. 1. Спектры поглощения 2-тиобарбиту­ ровой кислоты и продукта гидролиза тет-

антиокислителей не мешает развитию цветной реакции продуктов окислительной порчи с 2-тиобарбитуровой кислотой (табл. 8).

Т а б л и ц а 8

Изменение интенсивности окраски с 2-тиобарбитуровой кислотой в зависимости от времени хранения печенья из овсяной муки

* Продукт имеет прогорклость.

Седлачек [90] разработал быстрый метод определения прогорк­ лости ядра грецкого ореха с применением 2-тиобарбитуровой кис­ лоты. Реакция производится в дистиллате. Исследования показа­ ли, что этот метод является хорошим индикатором прогорклости

26

грецких орехов. Сравнение твобарбитуратного метода с органолеп­

хов, определенная по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой нахо­

жание альдегидов по дифенилкарбазидному методу).

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ ПОРЧИ ЖИРОВ И МАСЕЛ ПО РЕАКЦИИ

С2-ТИОБАРБИТУРОВОЙ КИСЛОТОЙ [92]

Впробирку с притертой стеклянной пробкой отмеривают пи­

петкой или взвешивают 3 г масла или расплавленного жира и рас­ творяют в 10 мл бензола, свободного от тиофена, или четырех­ хлористого углерода. При помощи пипетки вносят 10 мл реактива

2-тиобарбитуровой кислоты и встряхивают пробирку в горизон­

тальном положении на качалке в течение 4 мин. (приблизительно 125 колебаний в минуту). Содержимое пробирки переносят в де­ лительную воронку и водный слой сливают в пробирку размером

спектрофотометра. Поглощение окрашенного в красный цвет рас­ твора измеряют при длине волны 530 ммк против дистиллирован­ ной воды.

Результаты анализа выражают в величинах оптической плот­ ности.

27

Приготовление реактива 2-тиобарбитуровой кислоты

0,67 г химически чистой 2-тиобарбитуровой кислоты раство­ ряют в дистиллированной воде при нагревании (водяная или па­ ровая баня). Раствор переносят в мерную колбу емкостью 100 мл. охлаждают и доводят дистиллированной водой до метки. Один объем раствора смешивают с одним объемом ледяной уксусной кислоты.

Все применяемые реактивы должны быть химически чистыми, бензол должен быть свободен от тиофена.

КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ ДИСТИЛЛЯЦИОННЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОГОРКЛОСТИ С 2-ТИОБАРБИТУРОВОЙ КИСЛОТОЙ

Для быстрого определения окислительных изменений в жиро­

вой части орехового ядра Седлачек [90] разработал колориметри­ ческий дистилляционный метод с 2-тиобарбитуровой кислотой.

При этом методе отпадает необходимость в экстракции жира из орехового ядра; определение производится непосредственно.

В круглую колбу емкостью 500 мл со шлифом отвешивают 10 г тонкоизмельченных ядер и прибавляют 100 мл воды, 3 мл 3N раствора соляной кислоты, несколько стеклянных шариков и для

(насадку) со шлифом и холодильником Либиха длиной 50 см, ко­ торый заканчивается алонжем. Колбу нагревают на горелке с

асбестовой сеткой. Дистилляционную жидкость собирают в калиб­ рованный мерный цилиндр. Дистилляция должна проходить с та­ кой скоростью, чтобы в течение 10 мин. перегонялось 25 мл жид­

кости. В кювету размером 20X200 мм при помощи пипетки вносят 20 мл полученного дистиллята, 1 мл реактива 2-тиобарбитуровой кислоты и 1 мл концентрированной Н3РО4. Смесь перемешивают

и нагревают в течение 35 мин. в кипящей водяной бане. Одновре­ менно ставится слепой опыт. Интенсивность окраски (от розовой

до красной) измеряется колориметрически при длине волны 530 ммк (или с применением зеленого фильтра), результаты вы­ ражаются через экстинкцию.

охлажденный раствор добавляют 0,4 мл 3N раствора соляной кислоты и доводят его объем водой до 100 мл в мерной колбе.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРБОНИЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Определения карбонильных соединений в самоокисляющихся жирах имеет большое значение. Присутствие этих соединений, с

одной стороны, указывает на глубину окислительного процесса, а

28

с другой, — на развитие прогорклости, определяемой органолепти­ чески. Принято считать, что альдегиды и кетоны, как и низкомоле­ кулярные кислоты, являются носителями прогорклого запаха и

вкуса. Гептиловый, нониловый и в меньшей степени гексиловый и бутиловый альдегиды давно считались веществами, обусловливаю­ щими прогорклый запах и вкус жиров [76, 82].

На связь прогорклого вкуса и запаха жиров, пищи, кормов с

образованием карбонильных соединений указывали также другие авторы [30, 70, 98, 24а].

Неприятный вкус мяса и мясопродуктов, образовавшийся под действием ионизирующих излучений, связывают с появлением карбонильных соединений [16, 23].

Наиболее ранние работы относятся к определению кетонов.

Определение кетонов в жире по Тейфелю и Таллеру [99, 100] основано на применении салицилового альдегида, который в при­ сутствии соляной или серной кислоты дает с кетонами красное окрашивание.

Шмальфус и сотрудники [84] усовершенствовали этот метод, а

позже Шмальфус [85] превратил его в микрометод. Последний ме­ тод был применен Зиновьевым и др. [4] для определения накопле­ ния кетонов при прогоркании свиного топленого жира (табл. 10).

Энгель и Литвиненко [18] видоизменили метод Шмальфуса,

создав более удобную методику с возможностью количественного

определения. Окраска, получаемая при реакции кетонов с сали­

циловым альдегидом в присутствии соляной кислоты, определяет­ ся с помощью тинтометра Ловибонда.

Определение альдегидов в жирах с помощью фуксинсернистой кислоты подробно описано Зиновьевым и др. [1, 3, 4].

Инихов и Шошин [7] развили метод Кардашева и определили альдегиды количественно с фуксинсернистой кислотой в дистил­ ляте, отогнанном паром.

Зиновьев [4] подробно описал аналогичный метод, с помощью которого были получены данные по накоплению альдегидов в лярде (табл. 11).

. Метод Шибстед [83] с розанилином дает возможность прово­ дить реакцию без отгонки, применяя петролейный эфир.

Фуксинсернистая кислота готовится по прописям Шиффа,

Фелленберга [4].

Количественный колориметрический метод определения альде­ гидов в жирах с применением реактива Фелленберга разработан Петровым [11].

Был описан метод определения высших жирных альдегидов с применением фуксиносернистой кислоты [19, 20].

Ли [62] описал бисульфитный метод определения альдегидов

в окисленных жирах. Раствор жира в органическом растворителе обрабатывают раствором бисульфита, избыток бисульфита уда­ ляется при реакции с йодом. Альдегидбисульфитное соединение

29

лизе жиров (жирные кислоты) использовал хорошо известный в органической химии гидроксиламиновый метод с применением в качестве индикатора метилоранжа.

Кауфман и др. [52] для тех же целей применили в качестве индикатора бромфеноловый синий (20 г пиридина и 0,25 мл

4-процентного спиртового раствора бромфенолового синего разво­ дят 96-процентным этиловым спиртом до 1 литра). Авторы ука­ зывают, что при плохой растворимости исследуемого вещества в

холодном спирте, вместо спирта можно применять амиловый

спирт.

Суэрн и др. [56] описали гидроксиламиновый метод для опре­ деления карбонильных соединений в жировых материалах с при­ менением потенциометрического титрования.

Лаппин и Кларк [59] следы карбонильных соединений (алифа­ тических и ароматических альдегидов и кетонов, а также некото­ рых дикетонов), находящиеся в водных растворах и органических

растворителях (спиртах, эфирах, этилацетате, уксусной кислоте),

определяли по образованию виннокрасной окраски с 2,4-динитро- фенилгидразином в присутствии щелочи. Этот метод является простым и чувствительным.

Пул и Клаус [75] определение мопокарбонильных соединений в прогорклых жирах и других пищевых продуктах производили колориметрическим методом, основанным на образовании 2,4-ди- нитрофенилгидразонов. Авторы измерили спектральное поглоще­ ние 2,4-динитрофенилгидразонов ряда мопокарбонильных соедине­ ний при длине волны 435 jhjwc, применив для этого описанный ими метод. Они указывают, что спектральные кривые поглощения

30