книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

считать и удельную активность данного фермента или фермент­

д и г р а м м у бе л к а в ф е р м е и т и ом п р е п а р а т е . Содержание белка определяют либо по Кьельдалю (определяют содержание белкового азота и умножают на коэффициент 6,25), либо колориметрическим методом по Лоури, либо, если мы имеем совершенно прозрачный и неокрашенный раствор, спектрофото­ метрическим методом по Варбургу и Христиану. При определении по методу Варбурга и Христиана измеряют поглощение света при 280 ммк, что соответствует максимальному поглощению содержа­ щихся в белке ароматических аминокислот. Если раствор бес­ цветен и прозрачен и известей коэффициент поглощения чистого фермента при 280 ммк, метод Варбурга и Христиана очень удобен и быстр.

Наконец, рассмотрим понятие молекулярной активности фер­ мента. Н о д м о л е к у л я р н о й а к т и в н о с т ь ю п о ­ н и м а ю т ч и с л о м о л е к у л д а н н о г о с у б с т р а ­ т а и л и э к в и в а л е н т о в з а т р о н у т ы х г р у п п ,

п р е в р а щ а е м ы х з а о д н у м и н у т у о д н о й м о л е ­ к у л о й ф е р м е н т а п р и о п т и м а л ь н о й к о н ц е и-

т р а ц и и с у б с т р а т а (для определения молекулярной ак­ тивности фермента нужно знать его молекулярную массу).

Это понятие соответствует понятию числа оборотов, введенному в энзимологию Варбургом. Число оборотов по Варбургу — это число молей превращенного субстрата, приходящееся на моль фермента за минуту.

Л и т е р а т у р а

Умбрейт В. В., Буррис Р. X., Штауффер Д. Ф. Манометрические методы

изучения тканевого обмена. М., ИЛ, 1951.

Methods in Enzymology. Edited by S. P. Colowick and N. 0. Kaplan. N. Y., Academic Press:

Yol.l, 1955. Preparation and assay of enzymes; General preparative procedures, enzymes of carbohydrate metabolism, enzymes of lipid metabolism, en­ zymes of citric acid cycle.

Vol. 2, 1955. Preparation and assay of enzymes; Enzymes of protein metabo­ lism, enzymes of nucleic acid metabolism, enzymes of phosphate me­ tabolism, enzymes in coenzyme and vitamin metabolism, respiratory enzymes.

Vol. 3, 1957. Preparation and assay of substrates; Carbonydrates, lipids and steroids, citric acid cycle components, proteins and derivatives, nucleic acids and derivatives, coenzymes and related phosphate compounds, de­ termination of inorganic compounds.

Vol. 4, 1957. Special techniques for the enzymologist; Techniques for chara­ cterization of proteins, techniques for metabolic studies, technique for isotope studies.

Vol. 5, 1962. Preparation and assay of enzymes; General preparative proce­ dures, enzymes of carbohydrate metabolism, enzymes of lipid metabolism, enzymes of citric acid cycle, enzymes of protein metabolism.

59

Г л а в а 4

КОЭНЗИМЫ И ДРУГИЕ КОФАКТОРЫ

Термин к о э и з и м, или к о ф е р м е н т, был введен в на­ чале нынешнего столетия видным французским биохимиком Габ­ риэлем Бертраном для обозначения той части некоторых фермен­ тов, которая сравнительно легко удаляется через полупроницае­ мую перепонку при диализе. Позднее выяснилось, что многие фер­ менты являются двухкомпонентными, т. е. состоят из белка и свя­ занного с ним кофермента — термостабильного органического соединения небелковой природы, участвующего в действии фер­ мента в качестве обязательного кофактора. Белковая часть двух­ компонентного фермента получила название а н о ф е р м е и т.

Для коферментов, которые сравнительно прочно связаны с апоферментом, иногда предлагают пользоваться термином п р о с т е ­ ти ч е с к а я г р у п п а , применяемым в белковой химии для обозначения небелковой части протеидов. Однако такое под­ разделение неосновательно, так как один и тот же коферыент в од­ ном ферменте может быть связан очень слабо, а в другом доста­ точно прочно.

Врезультате ферментативных реакций коферменты, как пра­ вило, не подвергаются изменениям и этим отличаются от субстра­ тов. Однако нужно считаться с тем, что если мы имеем дело с ря­ дом последовательных ферментативных реакций, то, хотя кофермент в коночном счете регенерируется в исходной форме, он может представлять собой субстрат для отдельных ферментов, уча­ ствующих в этом сложном ферментативном процессе на том или ином его этапе.

Врезультате изучения химической природы коферментов выяснилось, что многие из них являются витаминами или произ­ водными витаминов. Так, например, пирофосфорный эфир вита­ мина Bj (тиамина) — один из важных коферментов; витамин В2

(рибофлавин) и витамин РР (амид никотиновой кислоты) входят в состав коэнзимов целого ряда окислительно-восстановительньтх ферментов. Витамин В6 (пиридоксин) в виде своих производных представляет собой коферменты ряда ферментов, катализирующих различные превращения аминокислот. Пантотеновая кислота, фолиевая кислота, биотин и производные витамина В]3 (цианокобаламипа) тоже входят в состав ферментов. Таким образом, уда­ лось установить, что витамины важны для нормальной жизне­ деятельности именно потому, что без них не образуются соот­ ветствующие ферментные системы, вследствие чего организм не может нормально функционировать.

61

Химическая природа коферментов, их функции в фермента­ тивных реакциях и механизм действия чрезвычайно разнообраз­ ны. В соответствии с их химическим строением коферменты можно подразделить на следующие группы:

1.Коферменты алифатического ряда.

2.Коферменты ароматического ряда.

3.Коферменты, являющиеся гетероциклическими соедине­ ниями.

4.Коферменты, являющиеся нуклеозидами и нуклеотидами.

1.Коферменты алифатического ряда Г л іо т а т и о н. Повсеместно распространен в клетках ра­

стений, животных и микроорганизмов трипептид, открытый вы­ дающимся английским биохимиком Ф. Г. Гопкннсом. Восста­ новленный глготатпон состоит их остатков L-глютаминовой ки­ слоты, L-цистеина и глицина и является т-В-глготамил-Ь-цистеи- нилглпцином:

О II

I I I

НООС—СИ—СНз—СН»—С—N—СН—С—N—СНз—СООН.

I I I I I

ШІ2 0 H СНз—SH

Обычно восстановленный глготатпон сокращенно обозначают как rSH. Восстановленный глготатпон очень легко окисляется, образуя форму TS-SB, и имеет важное значенію в окислительновосстановительных реакциях, протекающих в живой клетке. Вместе с тем глютатион в ряде ферментативных реакций играет роль специфического коэнзима. Так, например, он выступает в качестве коэнзима глиоксалазы I, катализирующей реакцию внутримолекулярного переноса водорода (диспропорционирова­ ния) при превращении метилглиоксаля в молочную кислоту:

СНз • СО ■СНО + rSI-I ^ СНзСН■ОН ■СО • sr.

Восстановленный глютатион является также коэнзимом не­ которых ферментов, катализирующих реакции изомеризации, на­ пример превращение кетоформы фенилпировиноградной кислоты в енольную и превращение ^zic-изомеров в щракс-изомеры (напри­ мер, производных малеиновой кислоты в производные фумаровой кислоты).

Л и п о е в а я к и с л о т а . Липоевая кислота представляет собой ростовой фактор для ряда микробов. Она содержится в дрож­ жах, микроорганизмах, растениях и животных тканях и имеет следующее строение:

62

Таким образом, липоевая кислота содержит дисульфидную связь—S—S—, которая легко разрывается с образованием двух сульфгидрильных групп — SH. Благодаря этому легко происхо­ дит окисление и восстановление липоевой кислоты, иа чем и ос­ нована ее коферментная функция.

Липоевая кислота является коферментом ряда окислительновосстановительных ферментов, которые участвуют в процессе окислительного декарбоксилироваиия кетокислот. В этих фер­ ментах липоевая кислота связана с белком своей карбоксильной группой. При этом свободная e-NH3-rpynna лизина апофермеита реагирует с карбоксилом липоевой кислоты с образованием пеп­ тидной связи:

Пептидная

связь

Нужно сказать, что некоторые другие коферменты также соединяются с белком через е-амипогруппу лизииа белка. В ча­ стности, таким же образом связывается с белком биотин (см. стр. 72).

2.Коферменты ароматического рлда

Ко э н з и м ы Q (у б и X и ы о н ы). Группа жирораствори­ мых коферментов носит название убихиноны, или коэнзимы Q. Название «убихиноны» означает, что в этих коферментах содер­ жатся хиноидные группировки. Приставка «уби» значит «повсюду», «везде»; действительно, убихиноны содержатся во всех живых клет­

ках. Убихиноны в своей основе имеют следующую структуру:

\ с/

II

о

63

обозначает, что данный коэизим обладает максимумом погло­ щения при длине волны, равной 254 ммк. Коэизим Q2 6 4 несколько позже был назван п л а с т о х и н о н о м, поскольку в листьях он содержится в хлоропластах, принадлежащих к группе суб­ клеточных структур растительной клетки, называемых п л а с т и ­ д а м и .

По своему строению пластохинон несколько отличается от других коэпзимов Q, что очевидно из приведенной ниже его фор­

II

о

Следовательно, он отличается от коэнзима Q9 тем, что в шестичлеином цикле пластохшіона содержатся метальные, а пе метоксильные остатки.

Какова же роль убихипонов и, в частности, пластохипона, в обмене веществ?

64

В свое время выдающийся физиолог и биохимик В. И. Пал­ ладии высказал предположение, что в процессе дыхания очень важную роль играют различные хиноны. В настоящее время доказано, что убихиноиы в животном организме, у микро­ организмов и растений имеют большое значение на последних этапах процесса дыхания, при переносе электронов с образованием в конечном счете воды; сейчас также установлено, что процесс фотосинтеза не может идти без участия пластохинона. Таким об­ разом, с открытием убихинонов и их важной роли в окислитель- но-восстаиовителытых процессах, происходящих в живой клетке, представление В. И. Палладина получило экспериментальное подтверждение.

3. Коферменты — гетероциклические соединения

К о ф е р м е н т ы — п р о и з в о д н ы е п и р и д о к с и - н а. Ряд различных реакций катализируется ферментами, коферментами которых являются производные пиридоксина (витамина В0).

Пиридоксин имеет следующее строение:

СН,ОН

СШШ-І

НзС-Д^

N

Витамин BGможет давать различные производные, и они, а не сам витамин Вв, входят в состав различных ферментов. Про­ изводными пиридоксина, играющими роль коферментов, явля­ ются пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат, строение кото­ рых представлено ниже:

Большинство ферментативных реакций, коферментами кото­ рых являются пиридоксальфосфат и пиридоксаминфосфат, свя­ зано с различными превращениями аминокислот.

Однако недавно было показано, что пиридоксальфосфат входит в состав фермента, который никакого отношения к

превращениям аминокислот не имеет, а имепно а-глюканфос- форилазы (см. стр. 215).

Роль пиридоксальфосфата в молекуле фосфорилазы заклю­ чается не в том, что он является ее коферментом, а в том, что альдегидная группа пиридок­ сальфосфата, связываясь с ами­ ногруппами фермента, поддер­ живает третичную структуру молекулы фосфорилазы. Стаби­ лизирующая роль пиридоксаль­ фосфата в молекуле мышечной фосфорилазы b ясно видна из данных, приведенных на рис. 25. Видно, что нативный фер­ мент значительно более устой­ чив к нагреванию, чем апофермепт. Инкубация апофермента в течение часа при 45° вызывает полную его денатурацию и пол­ ную потерю ферментативной ак­

тивности. При тех же условиях нативный фермент, содержащий пиридоксальфосфат, лишь на 5% снижает свою активность.

Одной из важных групп ферментов, у которых в качестве коферментов выступают пирндоксаль и его производные, являют­ ся аминотрансферазы, т. е. ферменты, которые переносят амино­ группы от одного соединения на другое.

Реакция ферментативного переамшшрования была открыта А. Е. Браушнтейпом с сотрудниками. Реакции переаминирования играют важную роль в обмене веществ. Наиболее важными ре­ акциями переаминирования являются следующие три. Первая из них такова:

HOOG—СІЕ—СІ-І2—СИ—СООН + НООС—СО—СНо—СООІ-І Фермент

Вторая важная' реакция переаминирования, катализируемая аминотрансферазой, это взаимодействие между глютаминовой и

пировииограднои кислотами:

В результате этой реакции из глютаминовой кислоты обра­ зуется ос-кетоглютаровая кислота, а из пировиноградной кислоты а-алаішн.

Рнс. 25. Влияние инкубации при разных температурах в точение 1 часа (pH 7,0) на фосфорилазу Ь (1) и апофосфорилазу Ь (2) (по Э. Фишеру и

сотр.).

И наконец, третья реакция ферментативного переаминирования — это реакция между аспарагиновой кислотой и дировино­ градной кислотой. В результате этой реакции образуется из аспа­ рагиновой кислоты соответствующая ей кетокислота — щавелево­ уксусная, а из пировиноградной кислоты — соответствующая ей аминокислота — а-алании.

НООС—СИг—СН—СООН + СНз—СО—СООН фермент

НООС—СНз—СО—СООН + СНз—СН—СООН

В последние годы, благодаря применению более чувствитель­ ных методов определения различных соединений, например ме­ тода хроматографии, удалось показать, что в живой клетке кроме трех указанных выше реакций протекают самые разнообразные реакции ферментативного переамииироваиия.

3* 67

Важную роль в обмене играют фосфопиридоксалевые фермен­

кислот углекислоты. Типичным представителем декарбоксилаз аминокислот является уже упоминавшаяся нами ранее глютаматдекарбоксилаза (см. стр. 54).

К числу декарбоксилаз аминокислот принадлежат также де­ карбоксилазы аспарагиновой кислоты или аспартатдекарбоксилазы. Под действием этих ферментов может происходить образо­ вание либо а-аланииа, либо ß-аланина, в зависимости от того, из какой карбоксильной группы аспарагиновой кислоты выде­

Эти две реакции катализируются разными ферментами, при­ чем оба фермента в качестве активной группы содержат фосфопиридоксаль. Таким образом, хотя коэнзим у этих обоих фермен­ тов одинаков, один фермент действует па одну карбоксильную группу, а другой — на другую. Необходимо отметить, что не все декарбоксилазы аминокислот содержат пиридоксальфосфат. Так, например, из некоторых микроорганизмов выделена гистидиндекарбоксилаза, не содержащая пиридоксальфосфата.

Ферменты третьей группы, содержащие в качестве коэнзимов пиридоксальфосфат, названы р а ц е м а з а м и а м и н о к и с ­ лот . Само название говорит о сущности реакции, катализируемой этими ферментами: они катализируют превращение одной опти­ ческой формы аминокислоты в другую. Если мы напишем реак­ цию, катализируемую этими ферментами, в общей форме, то полу­ чим следующее уравнение:

Н СООН R—СI—МНз ^ R—СI—Nlii

СООН Н

L-Аминокислота D-Аминокислота

Хорошим примером рацемаз аминокислот является рацемаза аланина, которая катализирует превращение L-алаиипа в D-ала- нин — так называемый неприродиый изомер аланина, содержа­ щийся в составе оболочек некоторых бактерий.

Важную роль в обмене веществ играют фосфопиридоксалевые ферменты, катализирующие превращение аминокислоты трип­

68