книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

Г л а в а 3

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ. ЕДИНИЦЫ ФЕРМЕНТОВ

Наличие фермента можно учесть по его действию в определен­ ных условиях, по скорости, с которой он катализирует ту или иную реакцию, т. е. по скорости накопления продуктов данной ферментативной реакции или по скорости исчезновения субстра­ та. Для этого применяются самые разнообразные методы — хи­ мические, поляриметрические, газометрические, хроматографиче­ ские, впскозиметрические, спектроскопические. Химические мето­ ды определения активности ферментов основаны па количествен­ ном учете тех или иных групп, а также веществ, образующихся или исчезающих в растворе в результате действия фермента. Для примера рассмотрим определение действия ß-фруктофуранози- дазы (сахаразы или пнвертазы). Этот фермент катализирует ре­ акцию гидролиза сахарозы с образованием одной молекулы глю­ козы н одной молекулы фруктозы:

Сг.І-ЬОп -Ь ІЕО —2G(iH]«Oti.

Известно, что сахароза не восстанавливает фелингову жид­ кость, потому что оба ее гликозидных гидроксила связаны. Когда происходит гидролиз сахарозы, связь между гликозидными гид­ роксилами разрывается и карбонильные группы образующейся глюкозы и фруктозы восстанавливают фелингову жидкость. Сле­ довательно, учитывая образование смеси глюкозы и фруктозы (так называемого иивертного сахара), по восстановлению фелинговой жидкости мы можем судить о действии сахаразы.

Этот же метод, основанный на использовании фелинговой жид­ кости, может быть применен для учета действия фермента ß- амилазы.

ß-Амилаза катализирует следующую реакцию:

Крахмал + ШО —>мальтоза + декстрины.

Мальтоза содержит одну свободную карбонильную группу и поэтому восстанавливает фелингову жидкость. Таким образом, действие амилазы можно учитывать путем определения мальтозы с помощью фелинговой жидкости или с помощью других методов определения восстанавливающих сахаров.

При определении действия протеолитических ферментов, т. е. ферментов, расщепляющих белки и пептиды, также пользуются

50

разными химическими методами. Если имеется дипептид, то под действием фермента дипептидазы происходит гидролиз дипепти­ да с образованием двух молекул аминокислот:

Дипептидаза

Дішептлд -j- Н2О---------------> 2 аминокислоты.

При гидролизе дипептида пептидная связь СО — NH разры­ вается с присоединением молекулы воды. При этом образуются свободная аминная группа и свободная карбоксильная группа. Поэтому для учета действия дипептидазы можпо применить лю­ бой метод, позволяющий определить накопление свободных кар­ боксильных или аминных групп. Часто учитывают освобожда­ ющиеся аминные группы с помощью так называемого формольного титрования по Сёреисеиу. Формольное титрование заключается в том, что раствор, содержащий продукты реакции, обрабатывают формалином. Формалин связывает свободные аминогруппы, и ос­ вобождаются карбоксильные группы, которые можпо оттитровать щелочью. Установив таким образом количество освобождающихся карбоксильных групп, можпо затем путем расчета определить содержание в исследуемом растворе свободных аминных групп.

Второй метод определения активности протеолитических фер­

ной концентрации. При этом в исследуемом растворе подавляется диссоциация аминных групп, и щелочью титруют освободившиеся

т. е. с присоединением трех молекул воды, то образуются глице­ рин и три молекулы жирных кислот.

Течение этой реакции можно учесть но количеству накаплива­ ющихся свободных жирных кислот, для чего можно применять титрование щелочью определенной концентрации.

Для определения действия некоторых ферментов пользуются поляриметрическим методом. Этот метод может быть применен, например, для учета действия ß-фруктофуранозидазы.

Применение поляриметрии основано на определении измене­ ния удельного вращения раствора по мере протекания фермента­

тивной реакции. Удельное вращение глюкозы [а]д равно +52,5°.

51

Раствор сахарозы имеет еще несколько большее правое вращение + 66,5°, а раствор фруктозы, которая образуется при гидролизе сахарозы, имеет очень значительное левое вращение, а именно —92,4°. Таким образом, если мы поместим в трубку поляриметра раствор сахарозы, содержащий фермент ß-фруктофуранозидазу, то наблюдается следующее явление. Исходный раствор сахарозы вращает вправо, причем это вращение равно +66,5°. По мере гидролиза накапливается фруктоза, поэтому правое вращение бу­ дет уменьшаться и в конце концов перейдет в левое.

Большая группа методов определения активности ферментов основана на применении газометрического метода, т. е. на коли­ чественном учете образующегося газа.

Так, например, для определения аминогрупп, освобождающих­ ся при ферментативном расщеплении белков и пептидов, пользу­ ются газометрическим методом Ван-Слайка. Этот метод заключа­ ется в том, что испытуемый раствор обрабатывают азотистой кис­ лотой HN02. Азотистая кислота количественно реагирует со сво­ бодными аминогруппами, и при этом выделяется газообразный молекулярный азот N2. Его собирают и определяют в специаль­ ной манометрической трубке, а затем путем пересчета определяют количество свободных аминогрупп.

Весьма совершенным газометрическим методом является ме­ тод Варбурга, основанный на применении аппарата, который так­ же носит имя О. Варбурга.

Этот аппарат устроен следующим образом (рис. 21, б). Главной его частью является градуированная манометрическая трубка (2), которая имеет два плеча и заполнена очень легкой подкрашен­ ной жидкостью. Снизу на манометрическую трубку надета зажатая зажимом каучуковая трубка (2), заткнутая пробкой. В той труб­ ке также находится подкрашенная жидкость. Вращая винт (3) зажима, можно регулировать уровень жидкости в обоих плечах манометрической трубки. Манометр соединяется одним своим пле­ чом со стеклянным сосудиком (5), в котором происходит та или иная ферментативная реакция. Сосудик присоединен к манометру на шлифе. Обычно сосудик аппарата Варбурга имеет в середине впаянный в дно стаканчик (6). Сосудик погружен в водяную баню большой емкости, в которой поддерживается строго определенная температура, чаще всего 25,00 или 30,00°. Весь аппарат соединен с моторчиком так, чтобы сосудик, в котором протекает реакция, мог бы встряхиваться и реакционная смесь могла бы все время перемешиваться. В термостат помещается целый ряд таких сосу­ диков, соединенных с манометрами (рис. 21, а).

Предположим, что с помощью аппарата Варбурга мы хотим изучить реакцию, катализируемую ферментом пируватдекарбоксилазой, который катализирует реакцию: СН3СО• СООН —>-С02 + + СН3СОН. Для этого с помощью крана (рис. 21, б, 4) мы уравни­ ваем уровень жидкости в обоих плечах манометра. Затем в сосу­ дик Варбурга вносим раствор пировиноградной кислоты и фер-

52

Рис. 21. Общий вид аппарата Варбурга (а) п схема манометра с сосуди­

ком (б)

1 — манометрическая трубка; 2 — каучуковая трубка; 3 — винт; -і — кран; 5 — опытныіі сосудик; в — центральный стаканчик; 7 — боковое ответвление

мент. Сосудики имеют на шлифе боковое ответвление (рис. 21, б, 7), куда можно поместить раствор фермента и добавить его в основное пространство сосудика поворотом бокового ответвления. Сосудик присоединяют к манометру, погружают в ванну и приводят в дви­ жение. Вследствие разложения пировиноградной кислоты выде­ ляется С02, причем будет развиваться избыточное давление, в ре­ зультате чего в правом плече манометра уровень жидкости пони­ зится, а в левом повысится. Через определенное время мы можем сделать замер и учесть таким образом действие пируватдекарбоксилазы. Если при ферментативной реакции происходит поглощение кислорода, сопровождающееся выделением эквивалентного ко­ личества С03, то в центральный стаканчик сосудика Варбурга помещают кусочек фильтровальной бумаги, смоченной крепкой щелочью, которая поглощает углекислый газ. В результате дав­ ление в системе будет уменьшаться, и уровень жидкости в правом колене монометра повысится.

Таким образом, пользуясь аппаратом Варбурга, можно опре­ делить интенсивность дыхания какой-либо ткани, плесневого гриба или бактериальной суспензии и количественно исследовать

53

ферментативные реакции, сопровождающиеся выделением или поглощением газа. Аппарат Варбурга чрезвычайно широко ис­ пользуется в эпзпмологип.

При изучении действия ферментов очень широко применяются также хроматографические методы, в частности хроматография на бумаге.

Предположим, что мы изучаем реакцию, которая происходит под действием фермента глютаматдекарбоксилазы. Этот фермент широко распространен у микроорганизмов, растений и живот­ ных. Он катализирует расщепление глютаминовой кпслоты на С02 н у-аминомаслянуго кислоту:

СООН—СНа—СИ«—СН—СООН — СО-. + НООС—CT-Ь—CH-.—CH2NH2.

I

ІЧТІз

Действие глютаматдекарбоксилазы мы можем проследить по выделению углекислоты, т. е. манометрически в аппарате Вар­ бурга. Однако это не всегда будет точно, потому что С02 может выделяться не только за счет именно этой реакции, но и за счет других реакций. Поэтому правильпей учитывать имеющуюся в реакционной смеси глютаминовую кислоту и образующуюся из нее у-ампномасляную кислоту. Это можно сделать при помощи количественной хроматографии на бумаге или в специальном ав­ томатическом аппарате для количественного определения амино­ кислот.

Предположим, что мы хотпм изучить хроматографическим методом ферментативную реакцию, например реакцию взаимо­ действия между пировипоградпой п глютаминовой кислотами. Глютаминовая кислота взаимодействует с пировипоградпой под действием фермента аланип — аминотрансферазы. Этот фермент, как следует из его названия, переносит аминогруппу от одного соединения к другому, в данном случае аминную группу от глю­ таминовой кислоты на пировииоградную:

СНз—СО—СООН + СООН—С Ш -С Н з -С Н -С О О Н =^=

NHa

СНз—СН—СООН + СООН—СНз—СНа—СО—СООН.

NHa

В результате этой реакции образуются сс-алаиин и а-кетоглю- таровая кислота.

При проведении опыта готовят смесь растворов пировипоградной и глютаминовой кислот, оставляют ее на некоторое время в присутствии ферментного препарата аминотрансферазы, а затем путем количественной хроматографии па бумаге определяют, сколько ббразовапось а-аланина и насколько уменьшилось со­ держание глютаминовой кислоты.

54

Таким образом, с помощью хроматографии па бумаге можно буквально воочию видеть, как образуется то или иное вещество, и количественно определить скорость реакции — какое количест­ во аланина образуется за определенный промежуток времепи и сколько при этом тратится глютаминовой кислоты.

Сейчас в биохимии и эизимологии очень широко применяется автоматический прибор для количественного определения амино­ кислот. Этот автомат, созданный С. Муром и У. Стейном, позволяет в течение нескольких часов количественно определить аминокислотный состав исследуемого раствора и таким образом по количеству образовавшихся аминокислот учесть действие дан­ ного фермента. Новейшие модели автоматических аминокислот­ ных анализаторов дают возможность провести полный анализ за один — два часа.

Следующая группа методов определения активности фермен­ тов — методы, основанные на изменении вязкости раствора. Эти методы применяются главным образом для изучения действия ферментов, расщепляющих белок, т. е. протеииаз, а также для определения действия пектолитическнх ферментов, т. е. фермен­ тов, расщепляющих пектиновые вещества.

Готовится раствор какого-либо белка, имеющий достаточно вязкую консистенцию; чаще всего применяют слабый раствор желатины. Этот раствор помещают в вискозиметр Оствальда. Вискозиметр, в свою очередь, помещают в водяной термостат при определенной температуре, например 30°, и определяют исходную вязкость желатины. Затем к раствору желатины добавляют ис­ следуемый ферментный препарат и начинают через определенные промежутки времени (например, через каждые 3 —5 мин.) из­ мерять вязкость раствора. Если исследуемый ферментный пре­ парат содержит протеиназу, то вязкость раствора непрерывно убывает.

Предположим, что нам нужно сравнить активность протеипаз

вразных образцах солода. Для этого можно получить вытяжку из солода и в совершенно одинаковых условиях установить, с ка­ кой скоростью она разжижает раствор желатины. Чем быстрее будет разжижаться желатина под действием вытяжки, тем более активными являются протеиназы солода.

Этот метод прост, удобен и позволяет уловить ранние этапы ферментативного гидролиза белка.

Следующая группа методов для определения действия фермен­ тов основана на применении электрометрического титрования. Так, например, с помощью специальных приборов для автомати­ ческого титрования можно судить о количестве накапливающихся

врастворе карбоксильных групп, причем самописец ведет запись результатов титрования.

Для изучения окислительно-восстановительных реакций, ка­ тализируемых некоторыми ферментами, довольно широко приме­ няются так называемые трубки Тунберга (рис. 22).

55

Трубка Туыберга — это пробирка со шлифом, в которой име­ ется отросток для откачивания воздуха из трубки. На шлифе трубку герметически закрывает стеклянная пробка, раздутая в изогнутый шарик, в который наливают соответствующий раст­ вор. Этот раствор может быть добавлен к основному раствору, находящемуся в пробирке, после того как из пробирки будет вы­

затем добавляем метиленовую синь к основному раствору и поме­ щаем трубку в термостат. Под действием дегидрогеназы (в дан­ ном случае лактатдегидрогеиазы) происходит обесцвечивание мети­ леновой сини. Чем быстрее обесцвечивается метиленовая синь, тем активнее изучаемая дегидрогеназа.

Этот способ определения активности дегидрогеназ использует­ ся в качестве ориентировочного. Вместо метиленовой сини в на­ стоящее время в качестве акцептора водорода широко применяют­ ся, особенно в гисто- и цитохимических работах, производные тетразолия, например трифенилтетразолийхлорид, который при восстановлении превращается в окрашенное вещество— формазан.

Последняя группа методов, очень широко применяемых в на­ стоящее время,— это спектрофотометрические методы. Как из­ вестно, спектрофотометром называется прибор, который дает возможность исследовать поглощение света раствором данного вещества при различной длине волны в инфракрасной, видимой или ультрафиолетовой части спектра.

Этот прибор особенно широко применяется при изучении окис­ лительно-восстановительных ферментов — оксидоредуктаз. В ка­ честве примера рассмотрим применение спектрофотометра для определения активности дегидрогеназ. Целый ряд дегидрогеназ в качестве своей составной части содержит никотииамидадеииндинуклеотид — НАД+ или никотинамидадениндинуклеотидфос-

56

фат — НАДФ+. Эти вещества существуют в клетке и в составе ферментов как в окисленной, так и в восстановленной форме. Их восстановленные формы обозначаются как НАД-Н и НАДФ-Н. Окисленные и восстановленные формы этих соединений, как пока­ зал О. Варбург, резко различаются по. своим спектрам и особен­ но по поглощению при длине волны 340 ммк. Это ясно видно па рис. 23. ■

По оси абсцисс отложена длина волны, а по оси ординат оп­ тическая плотность, характеризующая поглощение света данным раствором — так называемая экстинция, обозначаемая буквой

Рис. 23. Спектры поглощения НАД+ (1) п НАД-Н (2)

Рис. 24. Протекание ферментативной реакции во времени

Из рисунка видно, что при длине волны 340 ммк НАД+ не погло­ щает света, а восстановленная форма, НАД-Н, обладает значи­ тельным поглощением.

При обратимом превращении НАД+ в НАД-Н будет соответ­ ственно изменяться поглощение при 340 ммк. По изменению пог­ лощения при этой длине волны мы можем судить о том, с какой интенсивностью работает та или иная дегидрогеназа, а следова­ тельно, можем измерить скорость реакции. Благодаря своей точ­ ности и быстроте выполнения спектрофотометрические методы сейчас широчайшим образом применяются в энзимологии.

Любой ферментный препарат прежде всего должен быть оха­ рактеризован по его ферментативной активности. Для определе­ ния ферментативной активности того или иного препарата нужно учесть количество субстрата, превращенное этим препаратом за единицу времени, и отнести это значение к определенному коли­ честву самого ферментного препарата. Так, например, если мы имеем дело с ß-амилазой, то нужно определить количество крах­ мала, расщепленное за 1 мин. одним миллиграммом ферментного препарата. Комиссия по ферментам Международного биохимиче­ ского союза выработала понятие о стандартной единице фермента. Стандартная единица фермента обозначается на русском языке

57

заглавной бужвой Е (от слова «единица»), па английском языке она обозначается буквой U (unit).

С т а н д а р т н а я е д и н и ц а ф е р м е н т а — э т о т а ­ к о е к о л и ч е с т в о ф е р м е н т а , к о т о р о е к а т а ­ л и з и р у е т п р е в р а щ е н и е о д н о г о м и к р о м о л я

ления числа стандартных единиц фермента в исследуемом объ­ екте пользоваться температурой 25°, оптимальным pH для данного фермента и оптимальной концентрацией субстрата.

Для определения числа стандартных единиц нужно знать ско­ рость ферментативной реакции. Обычно ход фермептативиой ре­ акции может быть представлен в виде графика, изображенного на рис. 24.

Кривая сначала круто поднимается вверх, затем се подъем замедляется, и под конец опа идет почти параллельно оси абсцисс. Наблюдающееся замедление реакции может вызываться следзчощпмп причинами. Во-первых, влиянием образующихся продуктов реакции, поскольку в принципе каждая ферментатив­ ная реакция обратима, а в силу закона действучощих масс скорость реакции пропорциональна произведению концентраций реагирзчощих веществ. Во-вторых, уменьшением концентрации исход­ ного субстрата ниже насыщающей концентрации, поскольку ои потребляется в процессе реакции. Третья причина, которая во многих случаях имеет большое зпачеппе,— частпчпое разручпоиис самого фермента во время реакции. Наконец, падение скорости ферментативной реакции во времени в ряде случаев, даже если эта реакция необратима, вызывается специфическим торможением продуктами реакции. Примером подобного действия продуктов реакции может служить ипгпбпровапие ß-фруктофуфапозидазы фруктозой.

Поэтому, для того чтобы точно определить скорость реакции, протекающей под влиянием данного фермента, нужно учитывать ее в самом начале реакции, пока четыре указанных выше фактора не играют роли. В это время имеется избыток субстрата, продук­ тов реакции образовалось еще очень мало, и фермент еще не успел частично разрушиться. Обычно скорость реакции определяют в таких условиях, когда количество превращенного субстрата не превышает 20% от исходного.

При определении истинной начальной скорости ферментатив­ ной реакции особенное значение имеют те физические (например, спектрофотометрические) методы, которые дают возможность наблюдать за ходом реакции непрерывно. Вместе с тем важней­ шим условием правильного определения истинной начальной ско­ рости реакции является применение по возможности насыщающих концентраций субстрата.

Если мы определим начальную скорость фермептативной ре­ акции и, следовательно, активность фермента, то мы можем рас­

58