книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

39

удаляют электродные сосудики и к верхнему концу трубки под­ соединяют сосуд Н, наполненный соответствующим элюирующим раствором, который пропускают через электрофоретическую труб­ ку (рис. 14).

Элюирующий раствор, содержащий вымываемые им отдельные электрофоретические фракции, через капилляр, присоединенный к нижнему концу трубки (О), попадает в автоматический коллектор фракций (рис. 15). Этот последний представляет собою диск нз оргстекла, в котором по периферии имеются отверстия со встав­ ленными в них пробирками. Вытекающие из электрофоретической трубки отдельные порции жидкости (э ф ф л го е и т а) отмери­ ваются по весу или объему с помощью специального устройства

40

Мц

Схема 9. Разделенно смеси трех ферментов на адсорбционной колонке

и через вороночку попадают в отдельные пробирки. После того как такая порция стечет в пробирку, диск автоматически пово­ рачивается вокруг своей оси, подставляя под сифон следующую пробирку.

Между электрофоретической трубкой и коллектором фракций можно поместить самозаписывающий автомат, который будет ре­ гистрировать количество белка в каждой отдельной фракции.

Важный способ выделения и очистки ферментов — их изби­ рательная адсорбция из растворов. Этот способ, который впервые был прпменен А. Я. Данилевским и широко использовался Р. Вилынтеттером, заключается в том, что содержащийся в ра­ створе фермент адсорбирзгется определенным адсорбентом, напри­ мер гидратом окиси алюминия. Метод избирательной адсорбции из раствора применяется в ферментной промышленности для вы­ деления и очистки грибной и бактериальной амилазы. При этом в качестве адсорбента используется крахмал, который является специфическим адсорбентом для этого фермента.

Очень широкое применение в эизимологпп для разделения и очистки ферментов ползшили различные виды избирательной ад­ сорбции на колонках. Для заполнения подобных колонок исполь­ зуют различные адсорбенты. Широко применяется, например, гель трикальцнйфосфата Са3(Р04)2.

Если мы имеем стеклянную трубку, которая заполнена тем или иным адсорбентом, например гелем трпкальцпйфосфата, и будем пропускать через нее исследуемый раствор, содержащий различ­ ные ферменты, то разные ферменты адсорбируются в разных слоях, колонки, как это показано на схеме 9.

Затем при элюировании колонки соответствующим раствором можно последовательно вымыть ферменты из колонки, собирая отдельные фракции раствора с полшщыо коллектора фракций

41

it разделяя таким образом содержащиеся в растворе белки и в том числе ферменты (рис. 16). Ыа рис. 16 в качество примера раз­ деления белков п выделения фермента приведены результаты от­ деления пшеничной амилазы от других белков па колонке из геля фосфата кальция СаЛіР04• 211,0. В ряде случаев хорошим ад­ сорбентом для заполнения колонок является гель гидроксилапатпта Са3(Р04)3• ОН.

Егаомж

Рис.[16. Отдел(чіпс пшенич­ ной амилазы от неактивных белков на колонке из геля фосфата кальция (по Е. С. Зуевой, Л. С. Маркосяиу и Ы. И. Проскурякову)

a — кривая содержании белка но фракциях;

б — кривая амилазной актив­ ности фракций

енметилцеллюлозы н дпэтиламішоэтплцелліолозы (ДЭАЭ-цел- люлоза).

Говоря о различных методах разделения ферментов па колон­ ках, нужно отметить также получивший широкое применение метод гелевой фильтрации. Особенно часто при этом применяют препараты с фирменным названием с е ф а д е к с. Сефадексы представляют собою производные декстрана. Как известно, декстран является высокомолекулярным полисахаридом, образуе­ мым разными видами микроорганизмов Leuconostoc при развитии на растворах сахарозы. Молекулярная масса декстрана достигает миллиона п более. Молекула декстрана состоит из цепочек, обра­ зованных остатками глюкозы, связанными между собою '1 : 6- связями. Сефадексы получают нз декстрана путем его химической обработки, в результате которой в молекуле образуется развет­ вленная сеть поперечных связей, и вещество становится нераство­ римым в воде, но легко в ней набухает.

Применение сефадексов для разделения белков и ферментов основано на следующем. Допустим, что мы имеем хроматографи­ ческую колонку, заполненную пористыми частицами сефадекса, окруженными водной оболочкой, и уравновешенную каким-пи-

42

43

тода выделения и очистки фермента глготаматдегидрогеггазы (см. стр. 28) из одноклеточной зеленой водоросли хлореллы.

В клетках этого организма при выращивании на свету и дри использовании в качестве источника азота серпокислого аммония синтезируются две глтотаматдегидрогсттазы, различающиеся по своей специфичности к коферменту: одна работает как с ИАД+, так и с НАДФД а другая — только с НАДФ+. Сочетая опреде­ ленным образом вышеописанные приемы выделения ферментов, эти глютаматдегидрогепазы можно отделить друг от друга и полу­ чить в виде очищенных в 100—200 раз препаратов.

Рис. 17. Разделение иа сефадексе G-75 рибонуклеазы п протеаз пз экстракта поджелу­ дочной железы

J — рибонуклеаза; 2 — протеазы

Сначала выращенные клетки хлореллы разрушают, при этом содержимое клеток переходит в буферный раствор, затем эту смесь центрифугируют при 18 000 g для отделения неразрушенных кле­ ток, грубых частиц и других более мелких структур, не содер­ жащих глютаматдегпдрогеназ.

Полученную падосадочпую жидкость замораживают при

— 10—15° в течение 12 час., затем оттаивают и снова центрифуги­ руют на ультрацептрпфуго при 110 000 g в течение 1 часа. При этом разрушаются и удаляются комплексы хлорофилла с липопро­ теидами. Надосадочную жидкость после ультрацентрифугирова­ ния подвергают дифференциальному высаливанию сернокислым аммонием от 35 до 65% от полного насыщения. Белки, выпадающие в осадок в этой области, отделяют центрифугированием, перерастворяют в минимальном объеме буферного раствора и пропускают через колонку с сефадексом G-25. При прохождении через колонку с сефадексом раствор белка освобождается от сернокислого ам­ мония. Полученный белковый раствор наносят на колонку с ДЭАЭцеллюлозой, при этом белки с разной степенью прочности связы­ ваются с ионообменником. При элюировании колонки буферным раствором возрастающей концентрации происходит разделение белков.

О выходе того или иного фермента судят по его активности во фракциях элюата. В нашем случае глютаматдегидрогеиаза, спе­ цифичная к НАДФ+, элюируется при низкой ионной силе буфер­

44

ного раствора, а глготаматдегидрогеназа, работающая с обоими коферментами,— при высокой.

В настоящее время интенсивно развиваются работы по полу­ чению так называемых иммобилизованных ферментов, которые адсорбируются на колонках, заполненных каким-либо носителем, образующим нерастворимый комплекс с данным ферментом. В ка­ честве таких носителей применяют агарозу, целлюлозу, карбоксиметилсефадексы, ДЭАЭ-целлюлозы и т. п. При подборе соот­ ветствующего носителя можно получить иммобилизованный фермент с высокой активностью и, что особенно важно, весьма стабильный по отношению к денатурирующим агентам. Колонка, заполненная таким иммобилизованным ферментом, может быть многократно использована для проведения соответствующей ре­ акции. Иммобилизованные ферменты находят все более широкое применение в биохимической технологии. Так, например, фер­ мент аспартаза, катализирующий реакцию синтеза аспарагиновой кислоты из фумарата аммония, иммобилизованный на колонке из полиакриламидного геля, используется для непрерывного полу­ чения препарата аспарагиновой кислоты.

Кроме того, все более широкое применение для выделения и очистки ферментов находит аффинная хроматография ферментов на колонках, заполненных носителем, который строго избиратель­ но адсорбирует определенный фермент. В качестве примера вы­ сокой эффективности аффинной хроматографии ферментов можно привести очистку L-аспарагииазы (3.5.1.1) — фюрмента, который

впоследние годы привлекает к себе пристальное внимание в связи

стем, что ои оказался эффективным средством против некоторых форм опухолей. Обычный метод очистки этого фермента из Е. coli включает ряд стадий (тепловая денатурация, осаждение органи­ ческими растворителями, гельфильтрация, колоночная хромато­ графия), причем получаются препараты со сравнительно низкой

активностью. Путем аффинной хроматографии экстрактов из Е. coli на колонке из е-ампнокапроил-Б-аспарагниагарозы за один прием можно получить высокоочищенный препарат L-acna- рагиназы с активностью в 25—30 раз более высокой, чем при обыч­ ном способе выделения.

Иммобилизованные ферментные препараты и аффинная хро­ матография ферментов и других белков открывают новые пути для совершенствования биохимической и химической технологии и создания новых автоматизированных методов биохимического анализа.

При выделении и очистке ферментов особенно важное значение имеет низкая температура. При обычной температуре лабора­ тории многие ферменты денатурируются и частично или полностью теряют свою активность, поэтому желательно работать с фермен­ тами в специально оборудованных холодных комнатах.

При получении какого-либо очищенного ферментного препарата лучше всего выделить его в кристаллическом состоянии. В настоя­

45

щее время большое число ферментов получено в виде белковых кристаллов. Очищенный фермент в течение некоторого времени может быть сохранен в виде раствора. Однако хранить его нужно при пониженной температуре, лучше всего в замороженном со­ стоянии; даже при этом условии активность фермента сохраняется

недолго.

Очень хорошим способом хранения очищенных фермент­ ных препаратов, защищающим их от денатурации и снижения активности, является хранение при пониженной температуре в насыщенном растворе сернокислого аммония.

Рис. 18. Кривые растворимо­ сти белков

Очищенный раствор фермента или кристаллический фермент­ ный препарат может быть высушен. Для этого применяют различ­ ные способы. В ряде случаев с успехом может быть применена ва­ куум-сушка в присутствии какого-либо водопоглощающего ве­ щества, лучше всего Р20 5. Однако иаплучшпм способом является сушка путем лиофилизации, т. е. из замороженного состояния. При сушке путем лиофилизации белки и ферменты в подавляю­ щем большинстве случаев прекрасно сохраняют все свои свой­ ства.

Если получен препарат какого-то фермента, то возникает воп­ рос, каким образом мы можем убедиться в том, что этот фермент является действительно чистым, однородым, а не представляет собой смесь разных белков.

Существует ряд методов для определения степени чистоты и однородности белков.

Это, прежде всего, метод, основанный на определении раство­ римости данного белка при постоянном избытке нерастворенной фазы. Данный метод иллюстрируется рис. 18.

Отложив по оси абсцисс ata N в 1 мл суспензии белка при пол­ ном насыщении, а по оси ординат мг N в 1 мл фильтрата, в случае однородного белка мы получим кривую растворимости с одной точкой перелома, за которой следует горизонтальное плато — белок дальше не растворяется (рис. 18, 1).

Если мы имеем смесь двух ферментов, то получим кривую с двумя точками перелома (рис. 18,2). Имея дело со смесью не-

46

Скольких белков, мы НолуяиМ совершенно плавно идущую линию (рис. 18, 3).

Второй способ определения однородности белков, а следователь­ но, и ферментов — это электрофорез.

Фермент лактатдегидрогеназа, принадлежащий к классу окислительно-восстановительных ферментов, катализирует обра­ тимую реакцию превращения молочной кислоты в пировиноградную кислоту:

Этот фермент можно выделить из сердца теленка в виде кристал­ лического препарата. Но если этот кристаллический препарат под­ вергнуть электрофорезу при pH 5,5 и определенноіі ионной силе, то он дает два пика, изображенных на рис. 19.

Рис. 19. Электрофореграмма кристаллической лактатдегндрогеназы из сердца теленка

Таким образом, хотя в данном случае мы имеем дело с кристал­ лическим препаратом фермента, однако при электрофорезе он разделяется на два белка и, следовательно, является неоднород­ ным.

В последние годы широчайшее распространение при определении однородности белков и ферментов получил метод электрофореза в полиакриламидном геле. Этот метод требует очень малых ко­ личеств белка и чрезвычайно чувствителен.

Особенно высокой разделяющей способностью обладает метод изоэлектрической фокусировки белков, разработанный Свенссоном и Вестербергом.

Метод изоэлектрической электрофокусировки позволяет раз­ делить белки, отличающиеся своими изоэлектрическими точками. Фракционирование белков проводят в колонке, заполненной син­ тетическими амфолинами — смесью алифатических полиаминополикарбоновых кислот. Сочетание аминных и карбоксильных групп каждого отдельного амфолина смеси определяет характер его диссоциации. Под действием электрического поля амфолины распределяются по высоте колонки в строго определенной после­ довательности и создают линейный градиент pH. В электрическом поле колонки молекулы внесенного в нее белка перемещаются к аноду или катоду. При этом они проходят зоны с разными зна­ чениями pH. В зоне, где pH точно соответствует значению изо­ электрической точки белка, его молекулы становятся электро­

47

нейтральными и их движение прекращается — происходит фоку­ сирование белка. В разных зонах колонки фокусируются белки с разными значениями изозлектрических точек. Метод позволяет разделить белки, изозлектрические точки которых различаются на 0.02 pH. Шведская фирма «LKB» выпускает аппаратуру для изоолоктрической фокусировки белков, снабженную колонками как для аналитических, так и для препаративных целей.

Очень важным способом определения однородности белков, а следовательно, и ферментов является их исследование в ультра­ центрифуге. Принцип работы ультрацеитрифуги заключается в том. что раствор, содержащий белковые молекулы, подвергается очень мощному воздействию центробежной силы, превышающей приблизительно в 500 тыс. раз силу земного притяжения (g). При этом сначала осаждаются более тяжелые молекулы, затем — менее тяжелые. Таким образом с помощью ультрацеитрифуги можно разделить белки, различающиеся по своей молекулярной массе. Аналитическая ультрацентрифуга снабжена оптическим устрой­ ством, регистрирующим результаты анализа в виде кривой при прохождении света через специальные ячейки, содержащие ра­ створ исследуемого белка.

Если мы имеем дело с белком, который при данных условиях однороден по молекулярной массе, то при испытании его в уль­ трацентрифуге на кривой получается одни пик (рис, 20).

Рис. 20. Диаграмма а-амилазы

Bacillus sublilis и ультрацеит-

рпфугс (по К. Какиучн и сотр.)

В растпирс 0,5М NaCl — 0,05Л/

ацетата кальцин, pH 7,0

Если же на диаграмме получаются два пика, то это значит, что данный белковый препарат представляет собой смесь по мень­ шей мере двух разных белков.

Ультрацентрифугирование применяется как для определения однородности белковых препаратов, так и для определения моле­ кулярной массы белков, причем этот способ является одним из лучших способов определения молекулярных масс. Для определеиия'однородности белков и ферментов широко используются также разные виды хроматографии. Это уже рассмотренная нами ранее хроматография на колонках из геля трикальцийфосфата и гидроксилапатита, а также на колонках из карбоксиметилцеллюлозы и ДЭАЭ-целлюлозы.

Для того чтобы установить, является ли данный белок одно­ родным, необходимо сочетать разные методы, поскольку они ос­ нованы на различных принципах. Совершенно очевидно, что все эти методы определения однородности фермента должны сопровож­

48