книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

Таким образом, па примере глютаматдегидрогеназы мы ви­ дим, что четвертичная структура имеет большое значение для ферментативной активности и специфичности действия фер­ мента.

В создании третичной и четвертичной структуры белковой мо­ лекулы наряду с водородными связями важную роль играют также другие виды дополнительных связей, а именно ионные (солевые) связи и так называемые г и д р о ф о б н ы е в з а и м о д е й ­ с т в и я .

Как и водородные связи, они значительно слабее ковалентных химических связей, ио их роль в формировании и сохранении ла­ бильной структуры и ферментативных свойств белковой молекулы весьма велика. Ионные связи образуются между основными и кислотными группами белка. В качестве основных групп высту­ пают свободные аминогруппы — N-концевые аминогруппы полипептидных цепочек, е-амнногруппы остатков лизина, гуаниди­ новые группы аргпшша, имидазольные группы гистидина. Здесь нужно отметить, что в молекуле гистидина остаток имидазола со­ держит два атома азота, одни из которых в водных растворах обладает кислотными свойствами, а другой — основными, анало­ гично азоту пиридина. Такая двойственность химических функ­ ций имидазольной группировки проявляется в том, что содержа­ щиеся в белке остатки гистидина могут образовывать ионные связи как с кислотными группами белка, так и с некоторыми металлами, являющимися обязательными компонентами многих ферментов. Кислотные группы, участвующие в образовании ионных связей, представлены С-концевымп карбоксильными группами полппептидных цепочек и свободными карбоксильными группами остатков аспарагиновой и глютаминовой кислот.

Наиболее слабыми из всех дополнительных связей, имеющихся в белках, являются гидрофобные взаимодействия. Этим термином обозначают взаимодействие и сближение неполярных частей нолппептидных цепочек, сопровождающиеся ослаблением их взаимо­ действия с окружающей водой. Возникновение гидрофобных взаимодействий схематически можно представить так, как это по­ казано на рис. 8. Из рисунка видно, что гидрофобное взаимодей­ ствие возникает благодаря сближению двух неполярных групп до тех пор, пока они не соприкоснутся, причем это сближение сопро­ вождается уменьшением числа окружающих их молекул воды — молекулы воды как бы выталкиваются из той сферы, в которой воз­ никает гидрофобное взаимодействие. Способностью к гидрофоб­ ным взаимодействиям обладают остатки валина, лейцина, изо­ лейцина и фенилаланина, а также, возможно, пролина, аланина, триптофана, метионина и цистина. Мы можем наглядно представить себе сближение неполярных боковых групп двух аминокислот, сопровождающееся гидрофобным взаимодействием, в виде струк­ турных формул, изображенных на рис. 9. Как и другие некова­ лентные связи, гидрофобные взаимодействия играют важную роль

30

Рис. 8. Гидрофобное взаимодействие между двумя неполярными группами аланина и лейцина (изображены темным цветом); молекулы воды изображены в виде светлых кружков (по Дж. Не.мети н Г. Шерага)

Рнс. 9. Сближение неполярных боковых групп аминокислот в результате гидрофобного взаимодействия (по Г. Шерага)

я — между фенилаланином и леііцішом; О — между феннлалашшом и фенилаланином

всоздании и стабилизации той структуры, которая является спе­ цифической для каждого белка, а следовательно, и фермента. Не­ смотря на то что единичные гидрофобные взаимодействия, каждое

вотдельности, являются очень слабыми, благодаря коопера­ тивности многих таких взаимодействий возникают очень проч­ ные ассоциации, стабилизирующие структуру белковой мо­ лекулы.

Рассматривая роль гидрофобных взаимодействий в создании структуры белковой молекулы, нужно отметить, что впервые на важную роль гидрофобных участков полипептидной цепи в фор­ мировании конфигурации молекулы белка указали Д. Л. Талмуд п С. Е. Бреслер.

Если подытожить наши сведения о строении белков, то можно сказать, что они состоят пз аминокислотных остатков, связанных между собой пептидными связями н образующих полипептидные цепочки, которые, благодаря водородным и ионным связям, а также гидрофобным взаимодействиям, совершенно определенным об­

ских условиях, обеспечивается ковалентными н дополнительными связями, обусловливающими определенную жесткость структуры белковой молекулы, ее компактность и упорядоченность.

Изменение нативной конформации белковой молекулы, не

ключается в развертывании строго определенным образом уло­ женной в пространстве полипептидной цепочки и ее превращении в беспорядочный клубок.

Схематически процесс денатурации белковой молекулы изоб­ ражен на рпс. 10.

Денатурация фермепта в зависимости от ее степени сопровож­ дается нарушением вторичной, третичной и четвертичной струк­ туры белка, изменением его оптических свойств (спектральных и других характеристик), изменением реактивности отдельных хи­ мических группировок, от которых зависят каталитические свой­ ства фермента, и вследствие этого большей или меньшей потерей ферментативной активности.

Денатурация белка и потеря ферментативной активности мо­ гут происходить под влиянием различных факторов — повышен­ ной температуры, кислой или щелочной реакции среды, ионов тяжелых металлов, денатурирующих веществ, подобных моче­ вине или гуанидинхлориду, вызывающих разрыв водородных связей.

Таким образом, нативная конформация молекулы фермента — ее первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура обеспечивает свойственную данному ферменту каталитическую активность.

32

в результате чего нарушаются вторичная и третичная структуры белковой молекулы, что может быть прослежено по нарастанию характеристической вязкости белкового раствора. Если на нахоходящнйся в растворе трипсин воздействовать возрастающими концентрациями мочевины, то по мере нарушения его вторичной и третичной структуры н соответствующего нарастания характе­ ристической вязкости происходит одновременное падение его фер­ ментативной активности, которая в конце концов полностью исчезает, что ясно видно из рис. 11.

Концент рация мачевины, моли.

Этот опыт показывает, что обратимая денатурация белка, раз­ вертывание его полипептидной цепи и нарушение нативной кон­ формации белковой молекулы сопровождается потерей фермен­ тативной активности.

Вместе с тем здесь нужно подчеркнутъ, что, хотя белковая мо­ лекула н обладает строго определенной и достаточно жесткой структурой, глубокое нарушение которой приводит к денатура­ ции белка и потере ферментативной активности, эта ее «жесткость» относительна. Под влиянием различных воздействий (например, слабого нагревания, ингибиторов нлн тех или иных метаболитов, ионов металлов) могут происходить обратимые изменения конфор­ мации молекулы фермента, сопровождающиеся снижением или повышением его каталитической активности. Так, например, пу­ тем определения дисперсии оптического вращения для ряда фер­ ментов показано, что присоединение к ферменту субстрата или ин­

34

Л и т е р а т у р а

Гауровиц. Ф. Химия и функции белков. М., «Мир», 1965.

Киселев II. А. Электронная микроскопия биологических макромолекул.

М., «Наука», 1965.

Овчинников ІО. А. Исследование структуры белков н пептидов,— Вестп. АН

СССР, 1971, № 2, 58.

Овчинников ІО. А., Браунштейн А. Е. и др. Полная первпчпая структура

аспартат — аминотрансферазы.— Докл. АН СССР, 1972, 207, 728. Орехович В. II., Шпикшпер В. О. Некоторые вопросы изучения четвертичной

структуры белков.— Укр. біохіш. журн., 1965, 37, 769.

Птицын О. Б. Физические прнпцппы самоорганизации белковых ценен.—

Успехи совр. бнол. 1970, 69, 26.

Структура и стабильность биологических макромолекул. Перев. с англ, иод ред. М. В. Волькеиштеііна. М., «Мир», 1973.

Торчипский ІО. М. Сульфгидрильиыо и днсульфидные группы белков. М-,

«Наука», 1971.

Advances in Protein Chemistry, vol. 1—26. Edited by M. L. Anson and J. T. Edsall. N. Y., Academic Press, 1945—1972.

Anjinsen С. B. The formation and stabilisation of protein structure.— Biochem.

J., 1972, 128, 737.

Dickerson R. E.,Geis 1. The structure and action of proteins. N. Y., Harper and

Row, 1969.

Moore S ., Stein W. II. Chemical structure of pancreatic ribonuclease and deo­ xyribonuclease.— Science, 1973, 180, N 4085, 458.

Perutz M. F. X-Ray analysis, structure and function of enzymes.— Europ.

J. Biochem., 1969, 8, 455.

Scheraga II. A. The effect of solutes on the structure of water, its implication for protein structure.— Ann. N. Y. Acad. Sei., 1965, 125, 253.

Sund II., Weber К. Die Quartärstruktur der Proteine — Angew. Chemie, 1966,

78, 217.

The Proteins. Composition, structure and function, Edited by H. Neurath. N. Y., Academic Press, vol. 1 (1963). vol. 2 (1964), vol. 3 (1965), vol. 4 (1966), vol. 5 (1970).

Valentine II. C. Sub-units of the catalase molecule seen by electron mcroscopy.— Nature, 1964, 204, 1262.

Yon J. Structure et dynamique conformationelle des protéines. Paris, Heirmann,

1969.

2*

Г л а в а 2

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ

Каким же образом выделяют белки, а следовательно, и фер­ менты из того или иного материала? Обычный способ выделения ферментов — это получение экстрактов из предварительно из­ мельченного биологического материала — муки, солода, пророс­ ших семян, какой-либо животной ткани, бактериальной массы, мицелия гриба. В такой экстракт переходят различные белки и в том числе ферменты.

Очень часто при изучении действия ферментов пользуются так называемыми гомогенатами. Для получения гомогената отмы­ тую бактериальную массу, мицелий, растительную или животную ткань измельчают в ступке пли же в приборе, который называется гомогенизатором. При этом добавляют воду пли буферный раствор, а для лучшего разрушения клеток — мелкоизмельчеииое стекло или кварцевый песок. Получается кашица, которая носит наз­ вание г о м о г е и а т. Эта кашица содержит обрывки клеток, их ядра, хлоропласты листьев и другие органеллы клеток (мито­ хондрии и т. д.), пигменты, различные растворимые белки и т. д.

Измельчение суспензии клеток в воде пли буферном растворе может быть также произведено путем воздействия на них ультра­ звуком в специальном приборе, называемом ультразвуковым дезинтегратором. Этот способ в настоящее время применяется очень широко, особенно для разрушения бактериальных клеток. Однако в этом случае нужно подобрать такой режим обработки клеток ультразвуком, при котором не будет происходить инактивирование ферментов.

Гомогенат далее может быть подвергнут так называемому диф­ ференциальному центрифугированию, т. е. центрифугированию при различной увеличивающейся скорости. Так, например, можно начать центрифугирование при полутора тысячах g (1500g), т. е. при ускорении, превышающем ускорение силы тяжести в 1500 раз. После отделения частиц, осевших па дно центрифужных стакан­ чиков, центрифугируют при 20 тыс. g, затем при 40 тыс. g и т. д.

При 1500 g в осадок переходят хлоропласты (частицы, содер­ жащие хлорофилл!, при 20 тыс. g — митохондрии (частицы, в ко­ торых сосредоточены окислительно-восстановительные ферменты клеток). При более сильном центрифугировании, при 40 тыс. g и выше, оседают еще более мелкие частицы, находящиеся в гомоге­ нате. Для того чтобы сохранить структуру отдельных морфологи-

36

ческих частиц клетки (митохондрий, ядер и т. д.), к гомогенату при растирании материала и его последующем дифференциальном центрифугировании добавляют 5—8% сахарозы.

Если мы выделили таким образом из гомогената ту или иную фракцию субклеточных структур, то фермент, содержащийся в них, может находиться внутри этих структур (хлоропластов, митохондрий и т. д.) в связанном состоянии. Чтобы извлечь из них ферменты, перевести их в раствор, нужно разрушить соответ­ ствующие структуры. Обычно это делают путем применения так называемых д е т е р г е н т о в . Детергентами называют веще­ ства, обладающие очень высокой поверхностной активностью. Та­ кое вещество, будучи добавлено в небольшом количестве к сус­ пензии тех пли иных морфологических структур клетки, быстро их разрушает. Часто в качестве детергентов применяют так на­ зываемый «Твин» (это фирменное название производных сорбита II высокомолекулярных жирных кислот) пли дезоксихолат.

Другой способ освобождения ферментов, связанных в субкле­ точных структурах, заключается в попеременном замораживании и оттаивании исследуемой фракции субклеточных структур, вы­ деленных путем.дифференциального центрифугирования.

Для получения содержащего ферменты экстракта или гомоге­ ната можно использовать воду, буферный раствор, солевой ра­ створ (например, 10%-ный раствор хлористого натрия), смесь гли­ церина н воды (обычно 40% глицерина и 60% воды) или же орга­ нический растворитель (например, ацетон).

Для выделения многих ферментов также пользуются так на­ зываемыми ацетоновыми порошками. Этот способ заключается в том, что данный биологический материал, например ткань под­ желудочной железы пли проросшее зерно, прн растирании обра­ батывают несколько раз охлажденным ацетоном. Прн этом уда­ ляется целый ряд веществ жироподобной природы, некоторые смолы, красящие вещества и т. д. После высушивания получается однородный порошок, который затем экстрагируют буферным ра­ створом или другим растворителем и получают таким образом экстракт, содержащий те или иные ферменты. Этот способ хорош, но не для всех ферментов, так как некоторые из них инактиви­ руются ацетоном.

Каким же образом из водного или солевого экстракта, полу­ ченного тем или иным способом, можно выделить интересующий нас фермент? Это может быть сделано различными способами.

Наиболее старый способ, который еще в начале прошлого сто­ летия применили А. Пайен и Ж. Персо для выделения фермента амилазы из водного экстракта, полученного из солода, заключает­ ся в осаждении белков спиртом. Для этой цели используют также ацетон. Указанный способ выделения ферментов применяется до­ вольно широко и в настоящее время, в частности для получения препаратов амилазы из плесневых грибов. Так, например, неко­ торые японские фирмы производят препарат грибной амилазы

37

(такаднастаз) следующим образом. Гриб Aspergillus onjzae выра­ щивается па питательной среде определенного состава. Затем от­ деленный от среды мицелий гриба измельчается и экстрагируется, а нз профильтрованного экстракта спиртом определенной кон­ центрации осаждается ферментный препарат. Понятно, что при этом осаждается не одна лишь амилаза, а ряд ферментов и других белков.

Однако данный способ имеет существенный недостаток, ко­ торый заключается в том, что далеко не все ферменты выдержи­ вают обработку спиртом или ацетоном, так как при этом они денатурпруются п теряют свою активность.

Рис. 12. Электрофореграммы однородного (а) и неоднород­ ного (6) белка

Для того чтобы избежать денатурации и инактивации фермен­ тов при осаждении их из раствора органическими растворителями, необходимо эту операцию производить при низкой температуре, близкой к температуре замерзания смеси данного растворителя с водой.

Помимо осаждения органическими растворителями для выде­ ления ферментов применяется так называемое высаливанію. Это очень широко распространенный метод, который постоянно ис­ пользуется в научных исследованиях для получения высокоак­ тивных ферментных препаратов. Высаливание чаще всего произ­ водится с помощью сернокислого аммония (NH4)2S04, добавляе­ мого к исследуемому раствору в возрастающих количествах. Со­ держащий ферменты раствор вначале насыщают сернокислым аммонием, предположим, до 20% от полного насыщения. При этом выпадает какая-то часть белков и ферментов, осадок отделяют в центрифуге н исследуют на наличие соответствующей фермент­ ной активности. Раствор далее насыщают сернокислым аммонием, например, до 40% от полного насыщения, снова отделяют выпав­ ший осадок и исследуют его ферментативную активность. Остав­ шийся после центрифугирования раствор насыщают сернокислым аммонием до 60% от полного насыщения и снова отделяют выпав­ ший белковый осадок. Таким образом получают ряд белковых фракций, которые исследуют на наличие в них того или иного фермента.

Для выделения и разделения ферментов широко применяется препаративный электрофорез, введенный в биохимию главным об­

38