книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

На схеме строения молекулы инсулина (см. схему 1) видно, что в пей две полипептидные цепочки соединены затушеванными перемычками и, кроме того, имеется еще одна такая перемычка,

ми — S—S—, образованными двумя остатками цистеина. Таким образом, в молекуле инсулина имеется три таких связи. Дисуль­ фидные связи разрываются при восстановлении. Если, например, инсулин обработать восстанавливающим реактивом, то дисуль­ фидные связи разрываются и образуются две полипептидные це­ почки в свободном виде. При этом инсулин полностью теряет свою биологическую (гормональную) активность.

Как видно из схем 2 и 3, в рибоиуклеазе и лизоциме имеется по четыре дисульфидных связи. Оии скрепляют длинную поли­ пептидную цепочку, которая как бы свертывается в клубок. Как и в случае инсулина, если разрушить дисульфидные связи, то рибо­ нуклеаза и лизоцим теряют свою биологическую, в данном случае ферментативную, активность. Однако если, например, путем про­ дувания воздуха через раствор окислить образовавшиеся сульфгидридьные группы, то в белке снова образуются дисульфидиые связи. При этом, как показано на схеме 5, может восстановиться первоначальная структура молекулы белка и его ферментативная активность. Такое явление наблюдается, например, при окисле­ нии кислородом воздуха раствора предварительно восстановлен­ ной рибонуклеазы.

В некоторых случаях (схема 5, справа вверху) дисуль­ фидные связи снова образуются, но не в тех местах, где они были в нативном белке, и поэтому возникает белок, не обла­ дающий ферментативной активностью.

Рппптггипяприигга

Схема 5. Разрыв дисульфид­ ных связей в молекуле белка и их образование при окисле­ нии белка

20

Таким образом, в молекуле белка кроме полипептидиых свя­ зей, имеется еще один вид ковалентных связей, а именно дисуль­ фидные связи, которые либо скрепляют между собой отдельные полипептидньте цепочки, либо «стягивают» одну и ту же полипептидную цепочку. Имеются, однако, белки, например, белок ви­ руса табачной мозаики, в которых нет дисульфидиых связей.

Нуяшо подчеркнуть, что содержащиеся в белках сульфгидрильные группы — SH имеют большое значение для активности не­ которых ферментов. Если эти группы окислить, то фермент теряет свою активность.

Если представить себе полипептидную цепочку белка, то воз­ никают вопросы: каким образом эта длинная цепочка располо­ жена в пространстве и какие связи поддерживают эту простран­ ственную структуру молекулы? Здесь на первый план выступают так называемые в о д о р о д н ы е с в я з и . Как известно, водо­ родные связи являются нековалентными связями. Если для того чтобы разорвать обычную химическую (ковалентную) связь, нужно затратить от 20 до 2000 килокалорий, то для разрыва одной водо­ родной связи в водной среде нужно затратить всего лишь 1,5 ки­ локалории на моль. Таким образом, прочность водородных свя­ зей значительно меньше, чем прочность обычных ковалентных связей.

Водородные связи возникают между ковалентно-связанным водородным атомом, имеющим некоторый положительный заряд, и отрицательно заряженным ковалентно-связанным атомомакцептором. Примеры различных водородных связей, образую­ щихся в белках, приведены ниже.

21

Биологически наиболее важные водородные связи образуются водородными атомами, ковалентно связанными с кислородом или азотом. По всей вероятности, в образовании водородных связей принимают участие также и сульфгндрильиые группы белков.

Различные водородные связи отличаются друг от друга своей прочностью, которая зависит от химической природы атома-ак­ цептора и от направления водородной связи. Если водородный атом расположен непосредственно против атома-акцептора, то водород­ ная связь оудет более прочной (схема 6, а), чем при непрямом вза­ имодействии (схема 6, б).

Хотя водородные связи являются слабыми, однако они обра­ зуются в молекуле белка в очень большом количестве и поэтому играют важную роль в поддержании структуры белковой моле­ кулы. Если мы имеем длинную полнпептнднуіо цепочку, то в этой длинной цепп между отдельными ее частями возникают водо­ родные связи. В результате полипептидная цепочка как бы за­ кручивается по спирали. Таким образом возникает спиралевидная

Л. Полингом н его сотрудником Р. Кори главным образом на ос­ нове данных рентгеноструктуриого анализа.

Спиралевидная a -структура полипептпдной цепочки пред­ ставлена на схеме 7.

Из этой схемы видно, что один полный виток спирали включает 3,6 аминокислотных остатка, а «шаг» спирали, соответствующий одному аминокислотному остатку, имеет в длину 1,5 А.

Для установления степени сппралпзации белковых молекул пользуются определением удельного вращения плоскости поля­ ризованного света. Оказалось, что, чем больше степень спирализации белковой молекулы, тем сильнее изменяется удельное вра­ щение растворов белка. Особенно широко применяется измерение дисперсии оптического вращения (т. е. измерение удельного вра­ щения при различной длине волны) в приборе, называемом спектрополяриметром. Почти все белки, как легко растворимые, так и трудно растворимые, и почти все ферменты обладают а- структурой. Однако не все белки заспирализоваиы на всем протя-

22

жегши своих яолппептидных цепей. К числу таких белков, у ко­ торых полипептидиая цепочка заспиралнзовапа лишь частично, относятся, например, ферменты рибонуклеаза и лизоцим. Так,

вмолекуле лизоцима 42% полипептидиой цепочки засшіралнзовано

ввиде a-структуры. Спнрализоваиные участки молекулы лизо­ цима показаны на рис. 1.

Количество водородных связей в белковой молекуле может быть также определено с помощью метода, предложенного дат­ ским биохимиком К. У. Линдерстрём-Лаигом. Этот метод является чрезвычайно важным и чувствительным, позволяющим опреде­ лять, так сказать, динамическое состояние белковой молекулы. Он заключается в обработке белка, например рибонуклеазы или лизоцима, тяжелой водой D20, в которой вместо обычного водо­ рода содержится его тяжелый изотоп дейтерий. Если обработать белок Boo, то часть атомов водорода в белке будет замещена дей­ терием. Те атомы водорода, которые связаны с углеродом, совер­ шенно не обмениваются на дейтерий. Другая часть атомов водо­ рода заменяется дейтерием мгновенно, и, наконец, третья часть заменяется сравнительно медленно — в течение получаса, часа или двух часов. По-видимому, те атомы водорода, которые довольно медленно обмениваются на дейтерий, представляют собой водо­ род, участвующий в образовании водородных связей. Нужно от­ метить, что различные методы определения степени спирализацин полипептидиой цепочки дают результаты, хорошо совпадающие между собой. Так, например, определения процента спирализации молекулы лизоцима путем измерения оптического вра­ щения и путем замены водорода дейтерием дают близкие ве­ личины.

Кроме a -структуры в белках имеется также так называемая ß - с т р у к т у р а . Она образуется благодаря водородным связям,

23

7 0 ,

Рис. 1. Вторичная структура молекулы лизоцима из белка куриного япца (по К. Влеку и сотр.)

Из 129 аминокислотных остатков 55 образуют спиральные участки] полнпептидноіі це­ пи; на рисунке они обозначены утолщенными заштрихованными линиями. Дисульфпдныс мостики в молекуле обозначены черными прямоугольниками; цифры — номера ами­ нокислот в полипешпдноіі цени лизоцима

соединяющим расположенные рядом полппептндпые цепочки. В ре­ зультате возникает складчатая структура, которая изображена на схеме 8.

На этой схеме показаны три параллельно расположенные по­ липептидные цепочки, соединенные между собой водородными

Схема 8. ß-Структура полппептидных цепей-

24

связями и образующие структуру, в которой группы R располо­ жены над и под плоскостью «складчатого лпста». а- н ß-Структуры

спиралевидную структуру, можно различным образом упаковать в каком-то определенном объеме. Способ ее укладки в простран­ стве получил название т р е т и ч н о й с т р у к т у р ы белка. С помощью рентгеноструктурного анализа в настоящее время установлена третичная структура ряда белков и ферментов. Так, на рис. 2 изображена модель строения молекулы миоглобпна — белка, являющегося переносчиком кислорода в мышцах. В виде темной, изогнутой в разных направлениях трубки представлена имеющая спиралевидную структуру полипептидная цепочка, ко­ торая расположена определенным образом вокруг обозначенной более темным цветом содержащей железо активной группы миоглобина — так называемого гема. На рис. 3 и 4 даны модели тре­ тичной структуры молекулы лизоцима и рпбонуклазы, построен­ ные на основе данных рентгеноструктурного анализа.

Биологические свойства белков, в частности их ферментатив­ ные свойства, зависят в первую очередь от первичной структуры, т. е. аминокислотного состава и взаиморасположения аминокис­ лотных остатков. Они зависят также от вторичной структуры бел­ ка, т. е. от степени спирализации полнпептидной цепочки. На­ конец, третичная структура белка также оказывает чрезвычайно

Рпс. 2. Модель третичной структуры молекулы многлобина (по Д. Кепдрыо)

Вверху — гем в виде более темной плоской частицы

Рис. 3. Модель третичной структуры молекулы лизоцима (по К. Блеку и сотр.) 1 ■

25

Цифры обозначают расположение соответствующих аминокислотных остатков в полшіептпднои цепи. Дисульфидные связи расположены между аминокислотными остатками ДО и 95, 26 и 8Д, 5S и ПО, 65 и 72

большое влияние на действие фермента, на проявление его ката­

лекулы многих белков состоят из нескольких полипептидных це­ почек, соединенных между собой непептидными связями — водо­ родными, ионными (солевыми) или гидрофобными. Каждая молекула подобного белка состоит из нескольких субъединиц, ко­ торые, соединяясь между собой, образуют четвертичную струк­ туру белковой молекулы. Классическим примером подобного бел­ ка, обладающего четвертичной структурой, является гемоглобин, который имеет молекулярную массу 64 500, и молекула которого состоит из четырех полипептидных цепочек, причем одна их пара (a-цепи) имеет первичную структуру, отличную от другой пары (ß-цепи). Каждая пелипептидная цепь связана с атомом железа, заключенным в центре группы атомов,-образующих пигмент, на­ зываемый г е м о м, который придает крови свойственный ей красный цвет и от которого зависит способность гомоглобииа свя­ зывать кислород. На рис. 5 схематически показано строение мо­ лекулы гемоглобина.

26

Рис. 5. Схематическое изображение строения молекулы гемоглобина (по М. Перутцу)

Две идентичные полипептидные цепочки (<х-цепи) обозначены более светлым цветом, а две другие (ß-цепи) более темным, N —аминоконцы, С — карбо­ ксильные концы и-цепочек. В каждую цецочку как бы завернут гем, обозна­ ченный красным цветом

о с . і і " С 5 л " ч ч а я

аСКС^,-.:Г/:г;р

ал iVb."-Гі. г» г-

Молекулы белков, обладающих четвертичной структурой, при определенных условиях диссоциируют в растворе на субъединицы, которые при других Условиях могут обратимо ассоциировать, об­ разуя первоначальную молекулу. В принципе подобная обратимая диссоциация может происходить трояким образом.

Белковая молекула «Д а полипе ітидных цепочек Белковая молекула Щ а субъединиц гД х-а полппентидных цепочек

Белковая молекула “ а субъединиц + b полппептидпых цепочек, и далее а субъединиц д: х-а полппентидных цепочек

Обратимая диссоциация гемоглобина происходит как раз по второму типу и может быть вызвана добавлением мочевины, ко­ торая разрывает водородные связи. Схематически процесс диссо­ циации молекулы гемоглобина на две субъединицы, одна из ко­ торых содержит две а-цепи, а другая — две ß-цепи, представ­ лен на рис. 6. Из рисунка видно, что при удалении мочевины

Рис. 6. Обратимая диссо­ циация молекулы гемогло­ бина

субъединицы ассоциируют, образуя исходную молекулу гемо­ глобина.

Многие ферменты также обладают четвертичной структурой, что имеет большое значение для регулирования их действия в клет­ ке. К числу таких ферментов принадлежит каталаза, которая расщепляет перекись водорода иа кислород и воду в соответствии с уравнением

21-ІаО» — 2НаО -j- Oj.

Каталаза имеет молекулярную массу около 250 тыс. и содер­ жит четыре атома железа в молекуле. Молекула каталазы под дей­ ствием кислот и щелочей может диссоциировать иа более мелкие субмолекулы. Исследование кристаллической каталазы в элек­ тронном микроскопе в сочетании с критическим анализом ее хи­ мических и физических характеристик привело к представлению

27

о том, что молекула этого фермента состоит из шести субмолекул. Каждая такая субмолекула хорошо видна при большом увеличе­ нии в электронном микроскопе, она имеет форму интеграла н мо­ лекулярную массу 42 тыс.

На рис. 7 (1) показан вид кристаллической каталазы в элек­ тронном микроскопе; в нижней части рисунка, справа, хо­ рошо видны расположенные в плоскости рисунка интегра­ лоподобные субмолекулы каталазы. В средней части ри­ сунка, слева (рпс. 7, 2), дана модель, объясняющая расположение субмолекул каталазы в кристалле, соответствующее картине, по­ лучаемой в электронном микроскопе. В средней части, справа (рис. 7, 3), изображена модель половины молекулы каталазы. На гипотетической схеме, приведенной на рис. 7 (4), видно, что в мо­ лекуле каталазы имеются субмолекулы двух сортов. Каждая та­ кая субмолекула содержит по три полппептидиых цепочки (А, В, А и С, D, С) с молекулярной массой 14 тыс., состоящих из 120 аминокислотных остатков. В молекуле каталазы, таким образом, содержится шесть 1 субмолекул — четыре субмолекулы А, В, А и две субмолекулы С, D, С.

Обратимая диссоциация молекулы фермента хорошо изучена также на примере глютаматдегндрогеназы, которая катализирует реакцию

+2Н+

НООС—СНз—СНз—СО—СООН + М Н з^=іН О О С —СНз—

—2Н+

—СНз—СН—СООН + НзО

Для этого фермента показано, что его молекула, имеющая мо­ лекулярную массу около 1 млн, при одних условиях может дис­ социировать, распадаясь на более мелкие субъединицы, а при других — эти субъединицы могут соединяться, образуя исходную молекулу. Глютаматдегпдрогеназа при такой обратимой диссоциа­ ции и последующем изменении структуры субъединиц приобретает новое свойство. Эти субъединицы обладают свойствами фермента аланиндегидрогеназы, который катализирует следующую реак­ цию:

+ 2 H +

СІ-ІЗ— СО—СООН + NH3^ = b СНз—СН—СООН + НзО,

1 По другим данным, молекула каталазы состоит из четырех субмолекул (см. Я. А. Киселев, 1965; Europ. J. Biochem., 1967, 1, 400).

28