книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию
.pdfГ л а в а 1 0
РЕГУЛИРОВАНИЕ БИОСИНТЕЗА ФЕРМЕНТОВ
Вопрос об образовании ферментов в живой клетке является од ной из важнейших проблем энзимологии. Работами Р. Шенгеймора с сотрудниками, впервые применившими в широком масштабе изотопную методику для исследования обмена веществ у животных и растений, было показано, что в любой ткани с большей или мень шей скоростью происходит постоянное новообразование и обнов ление белков. Скорость этого обновления зависит от характера тка ни, ее возраста, физиологического состояния. В специализирован ных тканях, какими, например, являются пищеварительные желе зы, процесс синтеза специфических белков-ферментов происходит очень энергично и сопровождается их выделением в пищеваритель ный тракт. Особенно интенсивно синтез ферментов протекает в молодых, растущих тканях, подобных развивающемуся зародышу животного, прорастающему семени или развивающейся споре мик роорганизма.
Еще в 20-е годы А. Н. Бах и А. И. Опарин, исследуя процесс образования ферментов в прорастающих семенах, показали, что по мере прорастания значительно повышается активность протео литических и амилолитических ферментов. Эти данные были затем многократно подтверждены различными авторами. Однако неяс ным оставался вопрос о том, в какой мере происходящее при про растании семени увеличение активности фермента объясняется его новообразованием и в какой мере — освобождением этого фермента из связанного состояния или же превращением неактивного зимо гена в каталитически активный фермент. Четкий ответ на данный вопрос был получен лишь после введения в биохимию изотопной методики. С ее помощью было совершенно бесспорно показано, что процесс роста и развития зародыша, семени или споры дейст вительно сопровождается интенсивным новообразованием белков и ферментов. На рис. 94 представлена динамика поглощения кисло рода и включения радиоактивного фенилаланина в белки прораста ющих телоспор кукурузной головни (Ustilago maydis). Совершенно очевидно, что резкое увеличение скорости включения радиоактив ного фенилаланина в белки спор, характеризующее интенсивность синтеза белков, сопровождается столь же энергичным нарастанием интенсивности дыхания, поставляющего энергию, необходимую для осуществления процесса синтеза белка. С помощью изотопной ме тодики было также показано, что при набухании семян уже на
Z17
первых этапах прорастания начинается и со временем значительно усиливается процесс синтеза белков, прослеживаемый по включе нию в них радиоактивных аминокислот. Важно отметить, что рибо сомы, выделенные из сухих зародышей пшеницы или семядолей земляного ореха, практически лишены способности к включению (^''-аминокислот в белки, в то время как рибосомы, выделенные из набухших семян, уже обладают этой способностью. По мере набу хания происходит формирование полирибосом, и ужо на самых ран них его этапах начинается процесс активирования или синтеза
Рнс. ІМ. Включение С^'-феинл- алашша в белок (1) и погло
щенно кислорода (2) на раз личных стадиях прорастания телоспоры Uslilago maydis (по
Д. Готтлибу)
информационной РЫК. Однако здесь нужно отметить, что в про растающих семенах некоторые ферменты предсуществуют в виде неактивных форм, которые активируются уже на первых этапах прорастания.
Природа, так сказать, «набор» ферментов, образуемых данным организмом, определяется прежде всего генетическими факторами.
Это положение подтверждается огромным экспериментальным материалом, накопленным биохимией и биохимической генетикой. Особенно яркие примеры генетической обусловленности синтеза ферментов были получены при изучении их образования у низших организмов — плесневых грибов и бактерий. В этом отношении классическим примером является образование фермента трипто фан-синтазы у плесневого гриба Neurospora crassa. Обычный, дикий штамм этого гриба прекрасно растет и образует споры на синтети ческой среде, содержащей сахарозу, различные неорганические соли и биотин. Однако при массовом культивировании гриба можно обнаружить такие отдельные споры, которые растут на синтетичес кой среде только в том случае, если к ней добавить триптофан. Можно было думать, что штамм плесени, возникающий из подобной споры, лишен какого-то фермента, необходимого для синтеза трип тофана. Генетический анализ показал, что потребность^ трипто фане является признаком, передающимся по наследству в соответ ствии с законами Менделя. Вместе с тем оказалось, что неспособ ность к синтезу триптофана у такого мутантного штамма плесени действительно объясняется отсутствием у него фермента трипто-
Ш
фаи-сиитазы, катализирующего конденсацию индола и серина с образованием триптофана (см. стр. 69).
В качестве примера наследственного нарушения обмена ве ществ, возникающего в результате отсутствия в больном орга низме определенных ферментов, можно привести алкаптонурию. При этом наследственном заболевании у больных с мочой выде ляется гомогентизиновая кислота
ОН
ОН
Это соединение представляет собой продукт, образующийся в результате превращений тирозина. Гомогентизиновая кислота накапливается в организме и выделяется с мочой вследствие того, что у больных алкаптопурией утеряна способность к синтезу двух ферментов, катализирующих ее дальнейшее окисление,— ?г-окси- фенилпируватоксидазы и оксидазы гомогентизиновой кислоты.
Можно было бы привести значительное число примеров гене тического контроля синтеза ферментов, показывающих, что спо собность синтезировать тот или иной фермент зависит от наслед ственной природы данного организма. Однако еще в 1872 г. немецкий ученый М. Вортманн наблюдал, что если выращивать некоторые бактерии на средах без крахмала, то они не образуют амилолитических ферментов, а если их выращивать на крахмале как источнике углерода, то они образуют значительное количество амилазы. Это явление вслед за Вортманом наблюдали многие ис
следователи. Оно было |
названо э н з и м а т и ч е с к о й , или |
ф е р м е н т а т и в н о й |
а д а п т а ц и е й (приспособлением). |
Однако вслед за работами, которые показали подобное приспо собление микроорганизмов к среде, возникло предположение, что при этом не происходит новообразования фермента. В культуре имеется огромное количество клеток, причем они различаются по своим биохимическим свойствам. Возможно, что некоторые клетки данного микроорганизма и раньше содержали амилазу, но их было мало в данной культуре, поэтому этот фермент трудно было обнаружить. Если же добавить к культуре крахмал, то будут ин тенсивно размножаться только те клетки, которые уже раньше со держали амилазу. Остальные, лишенные амилазы клетки отомрут, поскольку они не смогут расщеплять крахмал и питаться им. Со гласно этому предположению, усиленное размножение клеток, со державших амилазу, приводит к тому, что мы находим этот фер мент в бактериальной культуре.
Для доказательства того, что при приспособлении микроорга низмов к новым условиям среды действительно происходит ново образование ферментов, Ф. Динерт в 1900 г. проводил опыты с
Ü79
дрожжами Saccharomyces luduHgii, которые обычно по сбраживают галактозу, но могут быть приучены к ее сбраживанию. Опыты Диперта были кратковременными, и размножения дрожжевых клеток при этом не происходило. Несмотря па это, дрожжи все же приобретали способность сбраживать галактозу. Таким обра зом, отпадает то возражение против возможности новообразова ния ферментов при адаптации, которое мы приводили выше. Такие дрожжи, «приученные» к сбраживанию галактозы, можно снова «перевоспитать», заставить их сбраживать глюкозу.
Однако опыты Диперта подверглись критике. Было высказано предположение о том, что дело заключается в непроницаемости дрожжевых клеток для галактозы. Первоначально якобы галак тоза просто не проникает в дрожжевые клетки, а затем при выра щивании дрожжей на галактозе клетки привыкают к ней и начи нают пропускать ее в клетку. В ответ на эти возражения англий ские биохимики А. Харден с сотрудниками и М. Стефенсон провели опыты с бесклеточными экстрактами из дрожжей п показали, что такие экстракты, полученные из дрожжей, первоначально ие сбра живавших галактозу, не содержат «галактозимазы» — комплекса ферментов, сбраживающих галактозу. После же приучения дрож жей к сбраживанию галактозы бесклеточные экстракты из таких адаптированных дрожжей содержат «галактозимазу». Таким обра зом, было доказано, что в клетках действительно происходит ново образование комплекса ферментов, катализирующего расщепление
исбраживание галактозы.
В1930 г. Г. Карстрем высказал предположение о том, что в клетке существуют две категории ферментов. Одна из них — так называемые к о и с т и т у т и в и ы е ферменты — ферменты, ко торые всегда присутствуют в клетках данного организма, посколь ку они входят в число обязательных компонентов клетки. Вторая
категория ферментов — а д а п т и в н ы е ферменты, которые заново образуются или образование которых резко усиливается в результате адаптации данного организма к условиям внешней сре ды. Название конститутивные ферменты применяется и сейчас, но, вместо термина адаптивные ферменты, теперь применяют наз вание и н д у ц и р у е м ы е ферменты, т. е. такие ферменты, об разование которых у данного организма может быть вызвано или резко ускорено тем или иным веществом, чаще всего соответст вующим субстратом, иа который действует данный фермент. Однако вскоре было показано (и сейчас это общепринято), что индуциро ванное образование фермента может быть вызвано ие только субст ратом данного фермента, но и некоторыми веществами, иа которые этот фермент совершенно ие действует (см. табл. 8 ).
Некоторые вещества ие индуцируют образование ферментов, а ингибируют его. Ферменты, синтез которых подавляется теми или иными соединениями, называют р е п р е с с и р у е м ы м и фер ментами. Типичным соединением, неспецифически подавляющим синтез ферментов, является глюкоза. Оиа подавляет образование
микроорганизмами ряда ферментов, например а-амилазы и триптофаназы — фермента, катализирующего расщепление триптофа на. Однако имеются некоторые более специфические виды репрес сии синтеза ферментов, заключающиеся в следующем. Если мы имеем какую-то ферментативную реакцию, то окончательный про дукт этой реакции может репрессировать образование фермента, катализирующего данную реакцию. Рассмотрим, папример, фер мент, довольно хорошо изученный у микроорганизмов, а именно триптофан-синтазу. Этот фермент катализирует уже описанную нами ранее реакцию синтеза триптофана из индола и серина:
|
Трип тсфаи - синтаза |
Индол + ссрнп |
-------------------------------------»триптофан. |
Синтез триптофан-синтазы репрессируется триптофаном. Если в культуральной среде присутствует избыток триптофана, то мик робы не синтезируют триптофаи-синтазу. Такой механизм, при котором продукт реакции репрессирует синтез фермента, назван м е х а н и з м о м об р а т и о й с в я з и .
Если мы имеем цепь ферментативных реакций
А — L Б В |
Г, |
т |
I |
то механизм обратной связи проявляется в том, что конечный про дукт этой цепи реакций — Г — ингибирует синтез ферментов, ка тализирующих отдельные этапы на пути к его образованию.
В дальнейшем развитии учения об индуцированных и консти тутивных ферментах важную роль сыграло изучение обмена ве ществ у дрожжей. Были проведены следующие опыты. Активные культуры дрожжей были помещены на среду, не содержащую азота, на которой не может происходить новообразования белка. Если в таких условиях при наличии соответствующего субстрата все же образуются индуцируемые ферменты, то совершенно ясно, что их образование происходит за счет собственных резервов белка, имеющихся в клетках. Опыты такого рода показали, что при адап тации дрожжей к галактозе и образовании «галактозішазы» одно временно снижается активность комплекса ферментов «глюкозимазы», катализирующего сбраживание глюкозы. Поскольку при этом не происходит новообразования белка, наблюдается как бы пере распределение белков в клетке. Белки комплекса «глюкозимазы» расщепляются до аминокислот и служат материалом для построе ния комплекса ферментов «галактозимазы».
Эти опыты наглядно показали, что при отсутствии новообразо вания белка па безазотистой среде под влиянием добавленного субстрата происходит образование одних ферментов за счет дру гих. Дальнейшее исследование адаптации дрожжей к сбражива нию галактозы показало, что при этом происходит образование
281
двух новых ферментов — галактокиназы и гексозо-1 -фосфат — уридилилтрансферазы.
Галактокиназа (2.7.1.6) катализирует следующую реакцию:
D-галактоза -|- А'і'Ф —- D-галактозо-1-фосфат + АДФ.
Гексозо-1-фосфат— уридилилтрансфераза (2.7.7.12) (см. стр. 8 6 ) катализирует реакцию превращения a-D-галактозо-і-фосфата в a-D-глюкозо-І-фосфат:
Следовательно, в результате действия галактокиназы образу ется галактозо-1 -фосфат, а гексозо-1 -фосфат — уридилилтранс фераза катализирует превращение галактозо-1 -фосфата в глюкозо- 1 -фосфат.
Весьма важным является вопрос о том, что происходит при адаптации дрожжей к сбраживанию галактозы — изменение са мого ферментного белка или его кофермента? Этот вопрос был раз решен остроумпьтмп опытами, которые заключались в следующем. Былп отдельно получены апофермеиты ферментного комплекса дрожжей и коферменты, проходящие при диализе через полупро ницаемую плойку. Эти апо- и коферменты были выделены из обыч ных дрожжей и пз дрожжей, адаптированных к галактозе. Затем были составлены комбинации апоферментов и кофермеитов, полу ченных из адаптировванных и неадаптированных дрожжей. При этом выяснилось, что если взять апофермеит из адаптированных дрожжей и кофермеит из неадаптированных, то такая комбинация сбраживает галактозу. Точно так же если взять апофермент и кофермент из адаптированных дрожжей, то и в этом случае происхо дит сбраживание галактозы. Если же берут апофермент и кофермент из неадаптированных дрожжей, то сбраживания галактозы не происходит. Наконец, если взять апофермент из неадаптирован ных и кофермеит из адаптированных дрожжей, то такая комбина ция также не сбраживает галактозу. Результаты этих опытов мож но проиллюстрировать следующим образом (А обозначает адап тированные дрожжи, иеА — неадаптированные):
Апофермент А -f кофермеит иеА — сбраживает галактозу, Апофермент А -|- кофермеит А — сбраживает галактозу, Апофермент неА -|- кофермеит неА — не сбраживает галактозу, Апофермент иеА + кофермеит А — не сбраживает галактозу.
Совершенно ясно, что при адаптации дрожжей к галактозе де ло заключается в образовании нового ферментного белка.
Очень хорошим примером индуцируемого фермента является пенициллиназа (3.5.2.6 ). Пегшциллиназа расщепляет ß-лактамітое кольцо в молекуле пенициллина, вследствие чего он теряет свою биологическую активность:
СІ-Ь. |
|
|
СГК |
|
|
>С-СН-СООН |
|
>C—CII-COOII |
|||
ci-m I |
I |
|
cim I |
|
I |
S |
N |
П снициллиназа |
S |
NH |
|
|
|
\ |
|
/ |
|
|
CH CO |
+ H 20 |
|
CII |
|
|
CH |
|
|
CM—СООИ |
|
|
NH—CO—R |
|
|
NH—CO —R |
|
|
Пенициллин |
|
Пегшцнллоішотп ннслота |
||
В результате широкого применения пенициллина в лечебной практике выработались новые штаммы микроорганизмов, иа ко торые пенициллин не действует. Особенно часто это имеет место в больницах. Эти устойчивые к пенициллину штаммы обладают мощной пенпциллиназой, которая быстро расщепляет пенициллин и таким образом делает его неактивным. В данном случае мы имеем прекрасный пример энзиматической адаптации. Оказывается что уже в концентрации ІО" 8 пенициллин индуцирует синтез пеиициллиназы. Синтез данного фермента происходит даже в том случае, если клетки микроба, например золотистого стафилококка (Sta phylococcus aureus), кратковременно при 0 ° и в отсутствие питатель ной среды обработать небольшими концентрациями пенициллина. В таких условиях в клетках микроба не может происходить синтез белка. По-видимому, при такой обработке пенициллин связыва ется с каким-то веществом в теле микроба, что способствует обра зованию пенициллииазы при последующем развитии микроорга низма. Это очень ясно показали опыты с меченым 33 5 -пеиицилли- ном. Если 335-пенициллином обработать клетки микроорганизма при таких условиях, когда ые происходит биосинтеза белка, то происходит связывание пенициллина на каких-то веществах клет ки, которые были названы рецепторами. Так, было установлено, что и н д у к т о р , вызывающий синтез индуцированного фер мента, связывается в клетке с каким-то рецептором, в результате чего начинается синтез соответствующего фермента.
Важные работы по индуцированному синтезу ферментов про ведены французскими биохимиками Ж. Моно и Ф. Жакобом с сот рудниками, изучавшими биосинтез индуцируемых ферментов у кишечной палочки Escherichia coli, являющейся чрезвычайно пластичным микроорганизмом. В качестве индуцируемого фермен та Жакоб и Моно особенно подробно исследовали ß-галактозидазу (3.2.1.23). Как показывает название, этот фермент расщепляет эфиры ß-галактозы, образующиеся при замещении гликозидного гидроксила. При культивировании в присутствии глюкозы как
единственного источника углерода Е. coli синтезирует только сле довые количества ß-галактозидазы. В присутствии же различных ß-галактозпдов образуются значительные количества итого фер мента — до 15— 7% от всех содержащихся в клетке белков. При этом клетки синтезируют ß-галактозидазу только лишь при нали чии того или иного соединения, индуцирующего синтез этого фер
мента. При удалении индуктора из питательной среды синтез фермента прекращается. Эта, можно сказать, автоматическая реакция клетки на изменение состава среды ясно видна па рис. ЯГ), на котором показано влия ние индуктора — лактозы на синтез ß-галактозидазы у Е. coli.
Моно и Жакоб исследовали инду цирующее действие па синтез ß-ra- лактозндазы целого ряда галактозидов. Некоторые из полученных ими результатов представлепт,і в табл. 8 .
Из табл. 8 видно, что, помимо такого природного субстрата ß-га лактозидазы, как лактоза, которая хорошо расщепляется этим фермен том и индуцирует его синтез, неко торые другие галактозиды, например
изопропил^-Б-тпогалактозид пли же MOTH.T-ß-D-тногалактозид, в колоссальной степени индуцируют синтез фермента, по совер шенно им не гидролизуются. В то яте время фенплотпл^-П-тиогала- ктозид практически почти не индуцирует синтез ß-галактозида зы и пе расщепляется ею, по обладает колоссальным сродством к этому ферменту. Такой природный а-галактозид, как мелибиоза, несмотря на то, что она и не гидролизуется ß-галактозидазой и практически не обладает сродством к ней, вдвое более активно
индуцирует синтез фермента, чем лактоза.
Как видно из рис. 95, клетка автоматически отвечает на воз действие того или иного индуктора пли соединения, репрессирую щего синтез фермента. Поэтому, так же как и в случае автомата, который может быть приведен в действие с помощью фальшивой мо неты, можно «обмануть» и клетку, воздействуя на нее соединением, весьма близким по своему строению к соответствующему субстрату данного фермента. Так, мы уже указывали выше, что изопропил- ß-D-тиогалактозид, хотя и не расщепляется ß-галактозидазой, од нако в колоссальной степени индуцирует ее синтез. Таким обра зом, сигнал был принят и механизм синтеза фермента сработал, но это был как бы фальшивый сигнал, который вынудил клетку синтезировать ненужный ей фермент. Подобные фальшивые сиг нальные метаболиты могут вызвать и репрессию синтеза фермен та. Так, например, аналог триптофана — 5-метилтриптофан, подоб-