книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

Рис. 92. Полнрпбосоімы ритпкулоцптов, ув. в 100 тыс. раз (по А. Ричу)

Ф. Липмаи считает, что подобные синтезы полипептпдных цепей без участия матричной РНК в процессе эволюции живого мира предшествовали современному рибосомальному механизму синтеза белков.

Рибосомы могут агрегировать — как бы слипаться друг с дру­ гом, образуя агрегаты. Подобная агрегация рибосом происходит под влиянием различных факторов, по особенио сильно под влия­ нием ионов магния. Отдельные рпбосомы соединяются друг с дру­ гом, образуя двойные рпбосомы (димеры); двойные рибосомы, в свою очередь, могут соединяться друг с другом с возникновением тетрамеров и т. д. На рис. 92 представлена фотография в электрон­ ном микроскопе рибосом из ретикулоцитов В Видно, что рибосомы

1 Ретикулоцпты — последняя стадия развития красных кровяных телец (эритроцитов).

2Ь7

белков - ферментовТаким образом, молекулы ДНК и РНК, играющие первостепенную роль в биосинтезе белка, требуют для своего синтеза наличия специфических ферментов.

Первоначально Северо Очоа с сотрудниками открыл фермента­ тивный синтез РНК под действием фермента, который был назван п о л и и у к л е о т и д ф о с ф о р и л а з о й (2.7.7.8 ) Р Этот фермент был получен ими впервые из почвенного микроорганизма Azotobacler vinelandii, который обладает способностью усваивать молекулярный азот воздуха и превращать его в аммиак и амино­

кислоты.

Действие полипуклеотпдфосфорплазы можно изобразить в виде следующей схемы.

аденозпндпфосфата (п) образуется полинуклеотид — нолиаденпловая кислота, содержащая ?гостатков адениловой кислоты; при этом выделяется п молекул фосфорной кислоты. Из схемы видно, что эта реакция обратима - Когда опа идет слева направо, то синтезируется нуклеиновая кислота. Правда, эта нуклеиновая кислота содержит только одно азотистое основание — адепин и представляет собой полиаденпловую кислоту. Важйо отметить, что полипуклеотидфосфорилаза работает только с затравкой, т. е. для того, чтобы фер­ мент действовал, следует добавить некоторое количество готового полимера. При этом нужно сказать, что эта затравка не обязательно должна быть высокомолекулярной, достаточно добавить даже динуклеотид, чтобы в присутствии аденозиндифосфата п полинуклеотидфосфорилазы начался синтез полинуклеотида. Очоа с сотрудника­ ми показал далее, что полинуклеотидфосфорилаза может синтези­ ровать ие только простые полинуклеотиды, содержащие только одно азотистое основание, в данном случае аденнн, но и сложные полинуклеотиды, в состав которых входят аденнн, гуанин, цито­ зин, урацпл п другие азотистые основанияПрепараты полипуклеотидфосфорилазы были выделены ими из самых разнообразных микроорганизмов•

Механизм синтеза РНК под действием полинуклеотидфосфорилазы показан на схеме 39.

Согласно этой схеме, присоединение нуклеотида к цепочке РНК или низкомолекулярной «затравке» происходит у третьего углерод­ ного атома рибозы, где имеется свободный гидроксил (обведен

1В соответствии с повой номенклатурой ферментов для данного фермента рекомендуется1тривиальное название полирибонуклеотрд — нуклеотидилтрансфераза.

269

Схема 39. Синтез РНК иод действием поли­ пуклеотцдфосфорнлазы (по С. Очоа)

пунктиром). Место, где происходит расщепление молекулы нуклеотиддифосфата, показано стрелкой. В результате реакции нук­ леотид присоединяется к третьему углеродному атому рибозы, и отщепляется молекула фосфорной кислоты. В соответствии с этим механизмом реакции происходит синтез целого ряда нуклеиновых кислот, как простых, так и сложных, содержащих различные азо­ тистые основания.

Биологическая роль полинуклеотидфосфорилазы неясна. Пред­ полагают, что она катализирует не синтез полирибонуклеотидных цепочек, а их деградацию путем фосфоролиза с образованием нуклеозиддифосфатов. Возможно также, что полинуклеотидфосфорилаза участвует в регуляции содержания в клетке неорганического фосфата.

За работами Очоа последовали работы Артура Корнберга, ко­ торый показал возможность ферментативного синтеза ДЫК. Из различных бактерий Корнберг выделил фермент, который был на-

270

зван Д Н К - п о л и м е р а з о й (2.7.7.7) 1. Этот фермент с моле­ кулярной массой около 1 0 0 тыс. в присутствии затравки катали­ зирует синтез ДНК из трифосфатов дезоксииуклеозидов. Реакция идет в соответствии со следующим суммарным уравнением:

Из этого уравнения видно, что под влиянием ДНК-полямеразы может идти не только синтез ДНК, но и ее распад с образованием нуклеозидтрифосфатов.

Механизм этой реакции может быть изображен следующим образом (X, Y и Z обозначают различные пуриновые и пиримиди­ новые основания):

I

Р

О

>, X

о

С

со

■&

и

о

О.

НО н

1 По новой номенклатуре ферментов — ДНК — нуклеотидилтрансфераза.

271

сутствии РНК и, по-видимому, играет важнейшую роль в возник­ новении злокачественных новообразований (см. стр. 268). В синтезе ДНК кроме ДНК-полимераз участвуют также ферменты, получив­ шие название Д Н К - л и г а з ы , катализирующие соединение ковалентными связями отдельных сегментов полинуклеотидной цепочки ДНК.

273

После откры тия Корпбергом ДНК-нолимеразы было показано, что у животных, растений и микробов имеется аналогичный фер­ мент, каталпзпрующші полимеризацию рибозонуклеозидтрифосфатов с образованием РНК. Этот фермент был назван Р Н К - п о-

л и м е р а з о іі (2 .7.7.6 ) П Катализируемая нм реакция идет в соответствии со следующей

схемой:

ДНК, Mg=+, Мп5+

Таким образом, РНК-полимераза катализирует синтез РНК, сопровождающийся выделением пирофосфата. Как видно из приве­ денного выше уравнения, реакция синтеза РНК идет только в при­ сутствии ДЫК. которая в данном случае играет роль матрицы. Мо­ лекула-олигомер РНК-полимеразы состоит из собственно фермен­ та с молекулярной массой около 400 000, образованного четырьмя полипептпдными цепями (2 а, ß и ß'), и более низкомолекулярного белка, получившего название сигма (сг)-фактора, имеющего молеку­ лярную массу 95 000. Сигма-фактор образует комплекс с собствен­ но ферментом и затем с молекулой ДНК, после чего начинается синтез РНК. Сигма-фактор высвобождается и может снова «рабо­ тать» с новой молекулой РНК-полимеразы (схема 41). На заклю­ чительном этапе спитеза РНК участвует еще один белковый фак­ тор, названный фактором ро (р) и имеющий молекулярную массу около 2 0 0 0 0 0 .

Схема 41. Цикл работы сигма-фактора

Е — молекула собственно РНК-полимеразы, состоя­ щая из четырех полшіептидных ценен (2а, ß и ß')

Электронномикроскопические исследования показали, что мо­ лекула РІЭК-полимеразы представляет собой как бы толстостенную трубку, стенки которой состоят из нескольких белковых цилинд­ ров, образующих внутри канал, через который как бы протягива­ ется молекула ДНК-матрицы (схема 42).

По-видимому, благодаря действию РНК-полимеразы синтези­ руются многие рибонуклеиновые кислоты, содержащиеся в клетке.

1 По повой номенклатуре ферментов — РНК — пуклеотидилтрансфераза.

274

Схема 42. Способ дейст­ вия и молекулярная структура РПК-полпме- разы (по Г. П. Георги­ еву)

Наряду с полинуклеотидфосфорюгазой и РНК-полимеразой в по­ следние годы открыт целый ряд ферментов, так или иначе участву­ ющих в синтезе различных полирибонуклеотидов.

В частности, в клетках кишечной палочки (Escherichia coli), зараженных определенными штаммами содержащих РНК бак­ териофагов, С. ПІпигельмаиом с сотрудниками открыта РНК-по- лимераза, требующая для своего действия затравки в виде РНК именно данного бактериофага. Очищенный препарат этого фермен­ та, иначе названного р е п л и к а з о й, из смеси нуклеозидтрифосфатов — АТФ, ЦТФ, УТФ и ГТФ в присутствии Mg2+ и за­ травки РНК из данного бактериофага синтезирует новые порции этой РНК. При этом чрезвычайно важно, что фаговая РНК, синте­ зированная под действием препарата репликазы, является инфек­ ционной — ее введение в клетки кишечной палочки вызывает раз­ множение соответствующего бактериофага. Следовательно, синте­ тическая РНК заключает всю полноту наследственной информации, необходимой для образования в клетке бактерии составных частей бактериофага. Эта работа имеет большое принципиальное значе­ ние, поскольку она показывает, что синтетическая РНК обладает свойственной ей биологической активностью (в данном случае ипфекционностыо) и вместе с тем содержит весь комплекс наследст­ венной информации, необходимой для возникновения и развития бактериофага.

Работы Очоа, Корнберга и последовавшие за ними исследования по ферментативному синтезу ДНК и РНК имели исключительно важное значение. Во-первых, они позволили синтезировать различ­ ные, имеющие определенный нуклеотидный состав, полимеры, ко­ торые были использованы в качестве информационных РНК при расшифровке нуклеотидно-аминокислотного кода. Во-вторых, стало ясно, что ферменты могут синтезировать не только различные низ­ комолекулярные соединения, но даже такие гигантские молекулы, как ДНК. В-третьих, было показано, что синтетические РНК обла­ дают биологической активностью и заключают в себе всю полноту генетической информации. Наконец, нужно подчеркнуть, что, хотя белки, а следовательно, и ферменты, в клетке синтезируются при обязательном решающем участии ДНК п РНК, эти последние, в

275