книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

Обычно липазы растительного и животного происхождения действуют таким образом, что сначала отщепляют один кислотный остаток, затем второй и, наконец, третий. Ниже мы приводим уравнение реакции, катализируемой липазой. Стрелкой показано, в каком месте присоединяется вода:

0Н2О . O CR3

Шифр 3.1.1.3 объединяет различные липазы, но они сильно отличаются друг от друга. Так, например, липаза семян клещеви­ ны нерастворима в воде. Оптимум ее действия находится при pH 4,7—5,0. Клещевинная липаза часто используется для изуче­ ния синтетического действия ферментов, поскольку она легко ка­ тализирует не только расщепление глицеридов, по и обратную реакцию синтеза глицеридов из глицерина и жирных кислот.

Рассмотрим теперь свойства липазы поджелудочной железы. Она очень активна и отличается от клещевинной липазы тем, что имеет оптимум действия в слабощелочной среде. Кроме того, эта липаза растворима. Другие липазы, например липаза микро­ организмов и пшеничных зародышей, также отличаются от липа­ зы клещевины тем, что они растворимы и имеют оптимум pH в слабощелочной среде, а именно при pH 8 .

Таким образом, хотя под шифром 3.1.1.3 объединены все липазы, они очень сильно отличаются друг от друга по своим свойствам.

Зерновая липаза участвует в процессе порчи зерновых про­ дуктов при хранении, особенно содержащих повышенное количест­ во жира, например овсяной муки или крупы и пшена.

Нужно отметить, что ни липаза, ни липоксигеназа почти не действуют в цельном зерне, когда овес или просо не обрушены. В этом случае прогоркания не происходит. Однако в овсяной муке, крупе или пшене при повышенной температуре хранения наступает довольно быстрое прогоркание. Оно является следствием действия двух ферментов — липазы и липоксигеназы.

Превращения веществ, происходящие при прогоркаиии муки или крупы, можно изобразить следующим образом:

Глицериды

Ширине кислоты + глицерин

Различные альдегиды и кетоны

218

Видно, что процесс прогоркания начинается с действия липазы, которая расщепляет глицериды на жирные кислоты и глицерин. Затем липоксигеназа, которая особенно энергично окисляет сво­ бодные, а не связанные в глицеридах жирные кислоты, превращает их в гидроперекиси. Эти последние окисляют различные вещества, в первую очередь жир, с образованием различных альдегидов и кето­ нов, обладающих неприятным запахом и вкусом.

Чтобы предохранить муку или крупу от прогоркания, нужно инактивировать липазу и липоксигеназу, для чего зерно, исполь­ зуемое для приготовления муки или крупы, подвергают обработке паром. Этот метод.применяется в Англии для обработки овса, иду­ щего на приготовление овсяной муки и крупы.

Рассмотрим далее ферменты, гидролизующие пектиновые ве­ щества. Эти ферменты, называемые и е к т о л и т и ч е с к и м и, имеют большое практическое значение, главным образом для по­ вышения выхода и осветления различных плодово-ягодных соков.

Особенно велико значение препаратов пектолитических фер­ ментов как средства для повышения выхода плодового сока в со­ ковом производстве — выход сока может быть повышен на 8 - 1 5%.

Каким же образом действуют пектолитичеекпе ферменты? Прежде всего нужно сказать, что пектиновые вещества обычно содержатся в растениях не в свободном виде, а в виде сложного комплекса веществ, называемого п р о т о п е к т и н о м . Состав этого комплекса можно изобразить следующим образом:

Протопектинааа

Арабап — метокешшрованная полпгалактуроновая кислота — галактаи.

Арабан представляет собой высокомолекулярный полисахарид, состоящий из остатков арабинозы, а галактан — из остатков га­ лактозы. Как видно из схемы, в протопектине содержится мето­ ксилированная полигалактуроновая кислота, содержащая метоксильные группы СН3 0 —.

Под действием пектолитических ферментов происходит отщеп­ ление арабана и галактана от протопектина. По-видимому, и ара­ бан, и галактан отщепляются ферментом протопектиназой. Не­ смотря на то что этот фермент не включен в список ферментов, указанных в новой классификации ферментов, все же он, по-ви- димому, существует, хотя еще не был выделен и надлежащим образом очищен. В результате действия этого фермента образу­ ется метоксилированная полигалактуроновая кислота, которая представляет собой так называемый растворимый пектин. Рас­ творимый пектин далее расщепляется другими пектолитическими ферментами.

На схеме 30 изображено строение растворимого пектина и стрелками показано место действия различных ферментов.

219

положение данного фермента в подгруппе ферментов с шифром

3 .1 .1 .

Ко второму подклассу гидролаз, имеющему шифр 3.2.1, т. е. к гидролизам гликозидов, относятся амилазы — ферменты, ката­ лизирующие гидролиз крахмала. Известны три типа амилаз — а-амилаза, ß-амилаза и так называемая глюканамилаза, или глю­ коамилаза. Все эти три фермента гидролизуют крахмал, но суще­ ственно отличаются друг от друга.

а - А м и л а з а (3.2.1.1) содержится в слюне, в проросшем зерне пшеницы, ржи и ячменя, выделяется поджелудочной желе­ зой, а также плесневыми грибами и бактериями; она расщепляет крахмал с образованней! главным образом декстринов и малого количества мальтозы. Образующиеся при этом декстрины явля­ ются сравнительно низкомолекулярными веществами и окраши­ ваются йодом в коричневый цвет.

Характерной особенностью всех а-амилаз является наличие в них по крайней мере одного грамм-атома прочно связанного кальция на моль фермента. Обработка фермента этилендиаминтетраацетатом,. связывающим кальций, приводит к его инактива­ ции. Как мы уже указывали ранее (стр. 113), роль кальция за­ ключается в том, что он стабилизирует вторичную и третичную структуру молекулы а-амилазы, обеспечивая таким образом ее каталитическую активность и вместе с тем предохраняя фермент от действия протеолитических ферментов.

В промышленности широко применяется а-амилаза из плесне­ вого гриба Aspergillus oryzae. Она имеет молекулярную массу 51 860 и получена в кристаллическом состоянии (рис. 6 8 ).

Р - А м и л а з а (3.2.1.2) расщепляет крахмал главным образом до мальтозы и небольшого количества высокомолекулярных дек­ стринов, которые окрашиваются йодом в синий цвет.

Г л ю к о а м и л а з а (3.2.1.3) расщепляет крахмал с образо­ ванием преимущественно глюкозы и небольшого количества дек­ стринов.

а- и ß-амилазы различаются своим отношением к pH : ß-ами­ лаза может работать при более кислой реакции, чем а-амилаза. Вместе с тем ß-амилаза более термолабильиа, чем а-амилаза; по­ следняя выдерживает более высокую температуру. Более того, оказывается, что различные а-амилазы отличаются по своей тер­ молабильности. Наиболее лабильной, т. е. быстрее всего разру­ шающейся при нагревании, является грибная а-амилаза. На вто­ ром месте стоит зерновая а-амилаза — фермент из проросшего зерна или солода, и наиболее устойчива к нагреванию бактери­ альная а-амилаза. Влияние температуры на активность различ­ ных а-амилаз показано на рис. 69. Из рисунка видно, что наиболее термолабильна а-амилаза из гриба Aspergillus oryzae.

Препараты грибной а-амилазы широко применяют в различных отраслях промышленности. Так, их используют в спиртовой про­ мышленности взамен солода для осахаривания крахмалистого

2 ? ,і

f-

t .

Рис. 68. Кристаллическая а-амилаза плесневого гриба Aspergillus oryzae (по Г. А. Молодовоп)

а — игольчатая форма (ув. в 600 раз); б — кубическая форма (ув. в 1800 раз)

сырья. В спиртовой промышленности Японии совершенно не при­ меняют солод, который полностью заменен грибными амилазами. Широко применяются препараты грибной амилазы в хлебопекар­ ной промышленности. При добавке в тесто грибной амилазы в коли­ честве 0,002—0,003% от веса муки усиливается гидролиз крахмала, и в тесте накапливается больше сахаров. В результате получается более объемистый хлеб, с лучшим цветом корки, лучшим вкусом и ароматом. Кроме того, добавка препаратов грибной амилазы дает возможность готовить тесто намного быстрее — время тестоведения зна­ чительно сокращается.

Ферментная промышленность, осо­ бенно в Японии, производит значи­ тельные количества препаратов а-ами- лазы из бактерии Bacillus subtilis.

Эта амилаза содержит половину грамм-атома цинка и три или четыре грамм-атома кальция на моль фер­ мента. Роль цинка заключается в том, что ои участвует в процессе обрати­ мой диссоциации и ассоциации моле­ кулы фермента, а кальций, как мы указывали выше, необходим для под­ держания нативной конформации и проявления ферментативной активно­ сти а-амилазы. Препараты глюко­ амилазы получают из плесневых гри­ бов. Поскольку она расщепляет крах­ мал до глюкозы, она представляет

собой весьма интересный фермент, потому что с ее помощью можно

рис. 70.

Обычно глюкозу готовят путем кислотного гидролиза крахмала соляной кислотой. Этот процесс осуществляется при повышенных температурах и давлении и требует сравнительно дорогого обору­ дования, стойкого по отношению к соляной кислоте. При этом часть образующейся глюкозы разлагается, часть ее образует продукты реверсии (трегалозу и другие олигосахариды), гидролизат полу­ чается окрашенный и требует дополнительной очистки. Применение грибных амилаз дает возможность получать глюкозу с большим выходом и более чистую. Ферментативный гидролиз крахмала с целью получения глюкозы производится в две стадии. Сначала крахмал превращается в декстрины путем гидролиза а-амилазой. 'Затем декстрины гидролизуются глюкоамилазой с образованием глюкозы. При этом способе выход глюкозы достигает 96—97% и

'Z23

гидролизат либо совершенно не окрашен, либо окрашен очень слабо. Глюкоамилазу получают обычно из грибов Aspergillus піger, Aspergillus usamii, Rhizopus niveus. Оптимум pH для действия глюкоамилазы лежит при 4,5—4,7. Хотя глюкоамилаза гидроли­ зует a-D (1 —>4)-, a-D (1 —> 6 )- и a-D (1 —>3)-глюкозидпые связи в различных олиго- и полисахаридах, однако гидролиз a-D (1 —> 4)-

связей происходит значительно быстрее. Молекулярная масса глю­ коамилазы Aspergillus niger равна 97 тыс.

глюкозу и фруктозу, т. е. получается ішвортный сахар. ß-Фрукто- фуранозидаза в большом количестве содержится в дрожжах, явля­ ющихся лучшим источником для получения ее препаратов. Гидро­ литическое расщепление сахарозы может быть осуществлено не только этим, но н другим ферментом, а именно а-глюкозидазой (3.2.1.20).

Действие этих двух ферментов иа молекулу сахарозы показа­ но на схеме 31.

Н2ОН

ш

ß-Фруктофуранозидаза гидролизует также рафинозу и метил-ß- D-фруктофураиозид, причем если относительную скорость гидро­ лиза сахарозы принять за 1 0 0 , то соответствующие скорости рас­ щепления этих соединений будут равны 47 и 77. Фермент ингиби­ руется ионами металлов. Полное ингибирование происходит под действием ионов ртути и свинца; частичное ингибирование вызыва­ ют ионы серебра, меди и цинка. Оптимум действия ß-фруктофура- позидазы находятся в широкой зоне pH от 4,0 до 5,5.

Рис. 71. Влияние pH на актив­ ность целлюлазы из плесне­ вых грибов (по П. Палу ц Б. Гошу)

J — Aspergillus tcvrcus', 2 — РспісШіит varialnlc

Препараты ß-фруктофурапозидазы применяются в кондитер­ ской промышленности. Дело в том, что сахароза очень легко крис­ таллизуется, а это весьма нежелательно при изготовлении всевоз­ можных начинок для конфет или помадок. Под действием ß-фрук- тофураиозидазы образуется инвертный сахар, который препятст­ вует кристаллизации сахарозы.

К числу ферментов, гидролизующих полисахариды, относится также ц е л л ю л а з а (3.2.1.4), которая гидролизует целлюлозу с полученном дисахарида целлобпозы и глюкозы. Этот фермент имеет молекулярную массу 49 тыс. и образуется некоторыми плес­ невыми грибами и бактериями.

Оптимум действия целлюлазьт плесневых грибов, как это видно на рис. 71, находится между pH 5,0 и 5,4.

Специфичность целлюлазы очень сильно зависит от источника фермента: препараты целлюлазы, получаемые из разных грибов, сильно различаются по способности расщеплять клетчатку, целлобиозу и другие глюканы.

Многочисленные производственные опыты показали, что полу­ ченные из плесневых грибов комплексные препараты целлюлазы, по-видимому содержащие также гемицеллюлазы, могут быть с ус­ пехом применены в разных отраслях народного хозяйства. Так, например, обработка ими кормов повышает усвояемость корма, вес животных и увеличивает яйценоскость кур. С помощью подобных комплексных препаратов целлюлазы удается повысить выход крахмала из крахмалистого сырья, выход агар-агара из морских водорослей и выход сока из мандаринов и других плодов. Однако в перспективе особенно многообещающим является примененеи

аминокислот. Таким обрТШ'м,- размер молекул субстрата рассмат­ ривался как фактор, определяющий специфичность действия фер­ ментов .

Протеиназы далее делили иа три группы:'ненбипазы, триптазы и папаиназы. Считали, что иепсииазы действуют на катионы бел­ ков, триптазы — иа анионы и папаиназы —на цвнттериопы. Пеп­ тидазы, в свою очередь, делили на аминопептидазы, для действия которых необходимо наличие в молекуле субстрата свободной NH2группы, карбоксипептидазы, для действия которых необходимо наличие свободной карбоксильной группы, и дипептидазы, гидро­ лизующие дипептиды (одновременное наличие свободных NH2- и СООИ-групп).

Успехи, достигнутые в области синтеза пептидов и других производных аминокислот, позволили установить, что протеина­ зы, по старым представлениям считавшиеся способными действо­ вать исключительно на белки, могут также гидролизовать низко­ молекулярные пептиды при соблюдении определенных требований к строению молекулы субстрата. В связи с этим М. Бергмани и

допептидазы, в отличие от экзопептидаз, способны гидролизовать не только концевые пептидные связи, но и связи, расположенные внутри белковых молекул.

Однако эта классификация не нашла широкого применения, и старые термины протеиназы и пептидазы употребляются и в на­ стоящее время, хотя и не в своем первоначальном смысле. Согласно современной номенклатуре и классификации ферментов, протеоли­

зы). Шифр этой группы ферментов 3.4.1. Первая цифра обозначает класс гидролаз, вторая — подкласс пептид—гидролаз, третья — группу аминопептидаз. Отличительной чертой этих ферментов яв­ ляется то, что для их действия необходимо наличие в молекуле субстрата свободной сс-аминной группы:

широко распространен в природе. Обнаружен во всех исследован­ ных животных тканях, а также в растениях и микроорганизмах. Классическим источником для получения высокоочищенных пре­ паратов являются почки свиньи. Фермент обладает очень широким спектром действия и, хотя с наибольшей скоростью гидролизует соединения лейцина, расщепляет также многие пептиды и амиды, содержащие другие N-концевые аминокислоты.

8* 227