книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

Реакция, катализируемая этим ферментом, написанная в более развернутом виде, имеет следующий вид:

Этот фермент играет важную роль в процессах спиртового броження и дыхания.

Молекулярная масса кристаллической глпцеральдегидфосфатдегндрогеназы из различных источников (дрожжей, ске­ летных мышц) колеблется в пределах от 118 тыс. до 150 тыс. Фермент образует великолепные кристаллы, изображенные на рис. 61.

Четвертая из названных нами дегидрогеназ, работающая с НАД* пли НАДФ* в качестве акцептора водорода, это г л ю т а- м а т д е г п д р о г е н а з а . Ее систематическое название L-глю- тамат: НАД(Ф) — оксидоредуктаза (дезаминирующая). Субстрат — L-глютамат, продукт реакции — а-кетоглютарат.

Реакция, катализируемая этим ферментом, такова:

НООС—СІ-Ь—СПз—СН—СООН + НОН + НАД (Ф)+ ^

N1-1-2

^ НООС—СНз—СІ-Із—С-СООН + Nib + НАД (Ф)-Н + Н+.

II

О

В этой реакции глютаминовая кислота при участии воды и НАД* (или НАДФ+) дает а-кетоглютаровую кислоту, аммиак и НАД-Іі (или НАДФ-Н). Данная реакция имеет большое физио­ логическое значение. Именно благодаря ей у микроорганизмов и растений происходит усвоение аммиака. Это те, образно выра­ жаясь, главные ворота, через которые .неорганический азот, посту­ пающий в растение из почвы, входит в состав глютаминовой кис­ лоты и затем в состав других аминокислот и белков. Шифр глготаматдегидрогеназы — 1.4.1.3.

Что обозначают цифры шифра перечисленных нами оксидо­ редуктаз?

Первая цифра 1 обозначает, что данный фермент относится к классу оксидоредуктаз. Вторая цифра шифра — этот фермент действует на ту или иную группировку в молекуле субстрата,

198

аименно на группировку СН—ОН

вслучае алкогольдегидрогеиазы и лактатдегидрогеиазьтТретья цифра — акцептор водорода, от­

редуктазой. Вторая цифра показывает, иа какую группировку в молекуле субстрата действует фермент; в данном случае — на аль­ дегидную группу, обозначенную цифрой шифра 2. Третья циф­ ра 1 , как и в случае других рассматриваемых нами дегидрогеназ, означает, что акцептором водорода является НАД+. Четвер­ тая цифра шифра 1 2 — конкретный фермент, двенадцатый фер­ мент в данной подгруппе дегидрогеназ, действующих на альде­ гидную группу, кофермептом которых является НАД+.

Глютаматдегидрогеназа имеет шифр 1.4.1.3. Первая цифра обозначает, что этот фермент принадлежит к оксидоредуктазам. Вторая цифра — 4 — фермент действует па группировку СП — NH2, т. е. на аминокислоты. Третья цифра — 1 обозначает, что акцеп­ тор водорода — НАД’1 или НАДФ+. Четвертая цифра — 3—кон­ кретный фермент из данной подгруппы оксидоредуктаз, коферментом которых является НАД+ или НАДФ+ и которые дей­ ствуют на аминокислоты.

Таким образом, на примере дегидрогеназ мы рассмотрели принципы классификации и шифровки ферментов согласно ре­ комендациям Международной комиссии по классификации и номенклатуре ферментов. Важно подчеркнуть, что реакции, катализируемые пикотинамидпуклеотидными дегидрогеназам, обратимы. Однако в каждом конкретном случае необходимо знать

1У9

соотношенію скоростей прямой и обратной реакцииХотя реак­ ция, катализируемая глютаматдегидрогеназой, обратима, все же-, в физиологических условиях она направлена в сторону синтеза' глютаминовой кислоты, что имеет очень важное биологическоезпаченпе как важнейший механизм связывания аммиака. Так, например, под действием растительной глютаматдегидрогеназы реакция между аммиаком па-кетоглютаровой кислотой с образова­

лоты.

Весьма важно то обстоятельство, что отдельные никотинамиднуклеотпдиые дегидрогеназы могут взаимодействовать между собой. Это явление имеет большое физиологическое значение, так как оно лежит в основе взаимосвязи ферментативных окислитель­ но-восстановительных реакций в живой клетке-

Например, взаимодействие глнцеральдегидфосфатдегидрогеназы с алкогольдегидрогеназой можно изобразить следующим, образом:

СНоОР03Н2

При участии фермента глицеральдегидфосфатдегидрогеназы 3 -фосфоглицериновый альдегид окисляется в 1,3-дифосфоглице- риновую кислоту, при этом НАД+ превращается в свою восста­ новленную форму — НАД-Н.

Это последнее соединение в свою очередь является источни­ ком водорода для восстановления уксусного альдегида, который при участии алкогольдегидрогеназы превращается в этиловый спирт; при этом вновь регенерируется окисленная форма кофер­ мента — НАД+.

Таким образом, в данном случае мы имеем две сопряженные ферментативные рекции, в которых участвует один и тот же про­ межуточный акцептор водорода и в которых одна ішкотипамидиуклеотидная дегидрогеназа представляет собой акцептор водо­ рода от другой дегидрогеназы.

Однако особенно важные акцепторы водорода от ЫАД-Н — флавииовые дегидрогеназы', содержащие в качестве коэнзима ФАД или ФМН.

•т

табл. 4, — г л и к о л а т о к с и д а з а. Она играет важную роль в

.дыхании растений. Этот фермент впервые был открыт П. А. Ко­ лесниковым в высших растениях и в настоящее время получен

Т а б л и ц а 4

Характеристика некоторых дегидрогеназ флавпновой природы

в кристаллическом состоянии (рис. 62). Гликолатоксндаза пред­ ставляет собой флавопротеид и в качестве кофермента содержит ■флавинмононуклеотид.

2 Ü J

Схема действия глпколатоксидазы такова:

^с—соон

ну

Таким образом, в результате действия этого фермента глико­ левая кислота превращается в глиоксидевую кислоту, а ФМН — в ФМН-Но. Далее ФМН-Н2 реагирует с молекулярным кисло­ родом, придем регенерируется ФМН и образуется Н2 0 3. Сум­ марная реакция, катализируемая глнколатоксидазой, следую­ щая:

ТЮСІЬ-СООН -I-О-.-> НОС - СООН 1-Iпо...

Глнколатоксидаза является примером фермента группы флавпиовых дегидрогеназ, реагирующих иепосредствеппо с молеку­ лярным кислородом и образующих при этом перекись водорода.

Третья из помещенных памп в таблицу флавиповых дегид­ рогеназ катализирует обратимую реакцию окисления дпгидролппоевой кислоты в соответствии с уравнением

содержат две молекулы ФАД иа молекулу белкаМолекулярная масса этого фермента, выделенного из листьев шпината, равна 102 тыс. Эта флавнновая дегидрогеназа участвует в процессе окислительного декарбоксилирования кетокислот.

Значение дегидрогеназ в обмене веществ заключается в том, что эти ферменты катализируют первый этап процесса дыхания — отнятие водорода от окисляемого субстрата.

К классу оксидоредуктаз относится также упоминавшаяся нами ранее г л ю к о з о о к с и д а з а . Она была открыта еще в 1904 г. Іі. А- Максимовым в плесневых грибах. Опа окисляет глюкозу с образованием в конечном счете глюконовой кислоты. Шифр этого фермента 1.1.3.4. Его тривиальное или рабочее на­ звание— глюкозооксидаза, рациональное, или систематическое название этого фермента — ß-D-глюкоза: кислород — оксидо­ редуктаза.

20 2

Первая цифра шифра обозначает, что фермент принадлежит к классу оксидоредуктаз; вторая — фермент действует на СИОН группу глюкозы; третья — при отнятии водорода его акцептором служит газообразный кислород (а не НАД+, как в случае дегид­ рогеназ); четвертая цифра обозначает номер фермента в группе 1.1.3. Глюкозооксидаза кристаллизуется в виде тонких игл (рис63) и представляет собой флавопротеид с молекулярной массой 186 тыс. Белок в этом ферменте связан с двумя молекулами флавпиаденнидинуклеотпда. В главе 6 мы уже отмечали, что этот фермент является чрезвычайно специфичным, и приводили дан­ ные, из которых видно, что глюкозооксидаза плесневых грибов окисляет ß-D-глюкозу и практически не окисляет другие сахара, за исключением 2 -дезоігси-Б-глюкозы. Все остальные сахара окисляются глюкозооксидазой с ничтожной скоростью.

Глюкозооксидаза катализирует следующую реакцию (Б обо­ значает белок):

храниться в высушенном состоянии. Так, например, наличие в яйцах глюкозы приводит к тому, что при получении из яиц яичного порошка путем сушки, в процессе самой сушки и при хранении порошка образуются вещества, обладающие неприят­ ным вкусом и запахом. Это происходит потому, что глюкоза при сушке и хранении яичного порошка, особенно при повышенной температуре, легко вступает во взаимодействие со свободными аминными группами аминокислот и белков (так называемая реак­ ция Майара). Порошок темнеет, и образуется ряд веществ, обладающих неприятным вкусом и запахом. Поэтому до сушки из яичной массы нужно удалить глюкозу, для чего яичную массу обрабатывают глюкозооксидазой. В результате получается яич­ ный порошок, более стойкий при хранении.

В США препараты глюкозооксидазы применяются для удале­ ния кислорода из консервных банок и бутылок с различными на­ питками, например с пивом. Так, в банку с сухим молочным по­ рошком помещают полиэтиленовый пакетик, в котором содер­ жится раствор глюкозооксидазы и глюкозы в буфере с pH 5—6. Этот пакетик не пропускает жидкости, так что молочный порошок не увлажняется. В то же время через полиэтиленовую пленку проходит кислород, который таким образом удаляется из банки с сухим молоком.

Из числа оксидоредуктаз большое практическое значение име­ ет о-д и ф е п о л о к с и д а з а . Шифр этого фермента 1.10.3.1. Первая цифра обозначает, что фермент относится к классу оксидо­ редуктаз. Цифра 10 говорит о том, что этот фермент действует на о-дифенолы, а также на полнфенолы, дубильные вещества и моно­ фенолы, в частности на тирозин. Третья цифра шифра 3 свиде­ тельствует о том, что акцептором водорода служит газообразный кислород. Четвертая цифра 1 — этот фермент стоит первым в ряду других ферментов этой подгруппы, которая содержит всего

стве черного чая. Как известно, чайный лист сначала подвергается подвяливаншо, а затем обработке на так называемых роллерах. В роллере чайный лист проходит между двумя валками, причем ткани листа механически повреждаются. В результате дубильные вещества, которые содержатся в листе, вступают в контакт с о- днфенолоксидазой. Затем такие механически поврежденные листья некоторое время выдерживают при определенной температуре, при которой происходят ферментация чайного листа и окисление ду­ бильных веществ под действием о-дифенолоксидазы. При этом обра­ зуются темноокрашенные соединения, которые и определяют цвет черного чая.

205

о-Дифеиолоксидаза является купропротеидом, т. е. содержит в своем составе медь. Содержание меди в очищенных препаратах о-дифенолоксидазы составляет около 0 ,2 %, причем в свежепри­ готовленных препаратах фермента медь содержится в основном в восстановленной форме. Если каким-либо образом связать медь, то фермент полностью инактивируется. Так, если обработать рас­ твор фермента диэтилднтиокарбаматом, который связывает медь, то действие о-дифенолоксидазы полностью прекращается. Молекуляр­ ная масса высокоочищенной о-дифенолоксидазы шампиньона ко­ леблется в пределах 118—133 тыс. Молекула этого фермента при соответствующих условиях может обратимо диссоциировать па субъединицы. Типовая реакция, катализируемая о-дифенолоксида- зой, такова:

фенол превращается в о-хинон. Однако хиноны не обладают тем­ ным цветом, который развивается на срезе яблока или при фермен­ тации черного чая. Темный цвет возникает в результате дальней­ шего окисления хпнонов и полимеризации продуктов окисления с образованием темноокрашенных веществ.

При ферментативном окислении монофенола тирозина образу­ ются темноокрашенные вещества — меланины. Раньше считали, что эту реакцию катализирует особый фермент тирозиназа. Новей­ шие исследования показали, что тирозиназа идентична о-дифенол- оксидазе. Однако было установлено, что в зависимости от того, из какого источника получена о-дифенолоксидаза (из чайного лис­ та, какого-либо гриба, картофеля или яблока), способность ее к окислению о-дифенолов, полифенолов и монофенолов различна.

Более того, показано, что о-дифенолоксидаза может содержать­ ся в одном и том же организме в виде различных форм, отличаю­ щихся по своей специфичности и свойствам. Например, из шам­ пиньона (Agaricus bispora) путем препаративного электрофореза и хроматографии на гидроксилапатите выделены три гомогенных в ультрацентрифуге препарата тирозиназы, несколько различаю­ щихся по своему действию на монофенолы и о-дифенолы и по своему аминокислотному составу. Таким образом, в данном случае мы име­ ем дело с изоэнзимами тирозиназы.

о-Дифенолоксидаза играет важную роль в обмене веществ и в пищевой технологии. Достаточно сказать, что в результате дейст­

вие

вия этого фермента образуются вещества, определяющие цвет зрач­ ка глаза и окраску меланом, о-Дпфеиолоксидаза широко распрост­ ранена в растениях. Она имеет большое значение для физиоло­ гии растительной клетки. Дело в том, что о-дифенолоксидаза может играть роль фермента, который за счет кислорода воздуха окис­ ляет водород, отнятый дегидрогеназами от различных субстратов и вошедший в состав полифенолов. Цвет ржаного хлеба является результатом действия о-дифенолоксидазы на тирозин. Действие о- дифенолоксидазы может сказываться отрицательно в макаронной промышленности. Иногда партия муки, из которой должны приго­ товить макароны, имеет повышенную активность о-дифенолоксида- зьт. Поэтому макароны во время сушки сильно темнеют, и их то­ варная ценность резко снижается.

Отрицательное значение о-дифенолоксидазы в пищевой техно­ логии заключается также в том, что часто из-за ее действия пор­ тится готовый продукт многих пищевых производств. Так, при сушке картофеля или яблок часто происходит потемнение готового продукта именно в результате действия о-дифенолоксидазы. Уже при нарезании ломтиков картофеля часто наблюдается их потем­ нение, вследствие чего так называемый хрустящий картофель при­ обретает очень непривлекательный вид.

Существуют разные способы борьбы с этим явлением. Первый способ заключается в химической обработке продукта

перед сушкой. Она производится или бисульфитом натрия (NaIlS03), или же сернистым газом (S02). При соединении с водой бисульфит натрия и сернистый газ дают H ,S03, которая инактиви­ рует о-дифенолоксидазу. Этот способ очень эффективен. Поскольку сернистый газ и сернистая кислота являются сильными восстано­ вителями, они обесцвечивают даже те меланины, которые все же успели образоваться. Однако использование сернистой кислоты имеет и свои отрицательные стороны. Дело заключается в том, что H2 S03 может подвергаться окислению с образованием серной кис­ лоты. Серная кислота, в свою очередь, легко образует натриевую соль Na2 S04, которая, как известно, отрицательно действует на желудочно-кишечный тракт.

Второй способ борьбы с потемнением во время сутки картофе­ ля, плодов и овощей заключается в термической обработке про­ дуктов перед сушкой, т. е. в воздействии на них высокой темпера­ турой. Чаще всего это делается путем бланшировки (это слово происходит от французского слова blanche — «белый»). При бланшировке нарезанный картофель или другой продукт, который дол­ жен подвергнуться сушке, на несколько секунд погружают в кипя­ ток или же обрабатывают в особой камере паром. При этом о- дифенолоксидаза разрушается, а следовательно, в процессе сушки она уже не действует, и продукт получается светлым.

К числу оксидоредуктаз принадлежат также ферменты к а т а ­

207