книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

Липофильный

КОИТПКТМЫН

учисток

Схема 29. Механизм действия алкогольдепідрогеиазы почеші (по Г. Теорсллю)

АДФР — остаток адеіюзипдифосфатриОоэы, R — в случае этанола — GHj

Поскольку фосфопиридоксаль является коэнзимом многих ферментов, катализирующих самые разнообразные реакции, здесь уместно еще раз подчеркнуть, что специфичность действия дан­ ного конкретного пнридоксалевого фермента зависит от его бел­ кового компонента, его состава и структуры, от содержащихся в нем функциональных групп, их взаимодействия с коэнзимом и определенными субстратами.

Примером более сложной ферментативной реакции, в которой участвует кофермент и в качестве обязательного кофактора ме­ талл, является действие алкогольдегидрогеназы печени. Этот фермент катализирует следующую реакцию:

Алкоголь + НАД+ = альдегид или кетон -j- НАД • Н -f- Н+.

Согласно Г. Теореллю, механизм действия печеночной алко­ гольдегидрогеназы на алкоголь может быть представлен в виде схемы 29.

Из схемы очевидно, что прежде всего этанол своей метальной группой присоединяется к липофильному контактному участку фермента. Далее под влиянием положительно заряженного атома цинка водород ОН-группы выделяется в виде Н+-иона с одно­ временным образованием отрицательно заряженного алкоголята. Этот отрицательный заряд воспринимается соседним водородным атомом, который затем в виде гидрид-иона перемещается к чет­ вертому углеродному атому никотинамида. В результате воз­ никает НАД-Н и уксусный альдегид.

Если фермент обладает не одной, а несколькими каталити­ ческими активностями, то очевидно, что в проявлении каждой из этих активностей участвуют функциональные группы в различных

188

комбинациях. Мы рассмотрим этот вопрос па примере карбоксплслтидазы А, которая, как указывалось ранее (см. стр. 158), об­ ладает и пептидазиоіі и эстеразной активностью. Выяснилось, что если проацетилировать этот фермент в таких условиях, при кото­ рых замещаются свободные ОП-группы тирозина, то белок присое­ динит два ацетильных остатка. При этом полностью теряется пентидазпая активность фермента. Одновременно в семь раз воз­ растает эстеразная активность. Таким образом, чтобы фермент работал как пептидаза, необходимы свободные ОН-группы тиро­ зина, которые входят в состав активного центра этого фермента. Чтобы фермент работал как эстераза, свободные ОН-группы ти­ розина не нужны. Из того, что блокировка этих групп в семь раз повышает эстеразную аітівпость карбоксипептидазы, следует, что ОН-группы тирозина даже мешают проявлению эстеразной активности фермента. По-видимому, они каким-то образом влияют на третичную структуру фермента и конформацию активного центра, подавляя его эстеразное действие. Как мы уже отмечали ранее (см. стр. 110), если из молекулы карбоксппептидазы А уда­ лить атом цинка и заменить его кадмием, то при этом полностью исчезает пептидазная активность фермента, но резко возрастает его эстеразная активность. Таким образом, очевидно, что в ре­ зультате всех этих воздействий происходят гл5 'бокое изменение структуры активного центра и взаимодействия входящих в него функциональных групп. Вместе с тем ясно, что требования к конформационным и химическим условиям в активном центре, необходимые для осуществления пептидазиой и эстеразной актив­ ности, совершенно различны.

Говоря об активных центрах ферментов, нужно отметить, что некоторые ферменты имеют не один, а два и более активных цент­ ра. Так, например, алкогольдегидрогеназа печени с молекуляр­ ной массой 84 тыс. содержит два атома ципка, две молекулы НАД+ и имеет два активных центра, а алкогольдегидрогеназа дрож­ жей с молекулярной массой 151 тыс. содержит четыре атома цинка, четыре молекулы НАД+ н четыре активных центра на молекулу.

Когда Эмиль Фишер, говоря о специфичности действия фер­ ментов, сравнивал фермент и субстрат с ключом и замком, то он полагал, что фермент подходит к своему субстрату совершенно так же, как ключ к замку (см. стр. 160). Он считал, что фермент имеет жесткую структуру и что если «ключ» чуть-чуть изменен, то он уже не подойдет к данному «замку».

В последние годы выдвинута гипотеза, которая меняет пред­ ставление Фишера о жестком соответствии структуры фермента и субстрата, заменяя его представлением о гибких, эластичных активных центрах в молекуле фермента.

Эта гипотеза выдвинута американским энзимологом Д. Кошлендом и получила довольно широкое распространение. Кошленд считает, что конформация молекулы фермента и его активного

189

Рнс. 58. Изменение активного центра фермента (по Д. Кошленду)

А — С — функциональные группы активного центра

центра может изменяться под влиянием коэнзима и субстрата (рис. 58).

На этом рисунке схематически изображена молекула фер­ мента, а функциональные группы активного центра обозначены буквами А, В и С. Присоединение коэнзима или субстрата к ферменту вызывает соответствующее изменение структуры актив­ ного центра, и его функциональные группы могут расположиться таким образом, что начинается реакция (левая часть рисунка). Вещества, которые обладают слишком большой или слишком маленькой молекулой, хотя и соединяются с ферментом, однако не могут вызвать необходимой «расстановки» функциональных груши в активном центре. И поэтому реакция не идет (правая часть рнсушка).

Поскольку гипотеза Кошленда предполагает, что присоеди­ нение коэнзима или субстрата вызывает соответствующие изме­ нения конформации молекулы фермента, а следовательно, и актив­ ного центра, можно ожидать, что фермент при этом должен зна­ чительно изменить свои физико-химические свойства. В этом действительно можно убедиться на целом ряде примеров. Осо­ бенно хорошо изучена алкогольдегидрогеназа, исследованию ко­ торой посвящен ряд работ Г. Теорелля. 'Алкогольдегидрогеназа печени довольно быстро денатурируется и инактивируется под влиянием нагревания. Если же она образует комплекс с НАД+, НАД • Н или же с амидом изомасляной кислоты (АИК), являю­ щимся ее конкурентным ингибитором, так сказать квази-субст­ ратом, то это оказывает на фермент защитное действие. Если фер­ мент образует тройной комплекс фермент — ЫАД-Н — АИК, то при тех же условиях нагревания он практически не денатуриру­ ется и не инактивируется (рис. 59).

Об изменении конформации молекулы алкогольдегидрогеназы при образовании комплексов с коэнзимом или квази-субстратом свидетельствуют также данные, касающиеся реактивности SHгрупп.

190

800 аминокислотных остатков, составляющих полипептидную

цепочку алкогольдегидрогеназы, в результате комплексообразования 70 остатков аминокислот дополнительно образуют сс-структуру.

Хорошее подтверждение правильности идеи Кошленда об «индуцированном активном центре» было получено при изучении структуры и механизма действия карбоксипептидазы А. Этот фермент выделяется поджелудочной железой, состоит из 307 ами­ нокислотных остатков, образующих одну полипептиднуто цепь, и катализирует гидролиз в белках пептидной связи, находящейся по соседству с С-концевой аминокислотой. Оказалось, что при­ соединение к ферменту субстрата или ингибитора, представляю­ щего собою квази-субстрат, сопровождается значительными из­ менениями в молекуле карбоксипептидазы А. Они заключаются в том, что боковая цепочка 248-го остатка тирозина, входящего в активный центр, передвигается на 8 Â по направлению к суб­ страту и вследствие этого гидроксил тирозина сближается с гид­ ролизуемой пептидной связью; кроме того, положительно заря­ женная группа 145-го остатка аргинина перемещается на 2 Â по направлению к карбоксилу субстрата и связывается с ним. В дан­ ном случае изменения конформации фермента индуцирует имен­ но карбоксильная группа субстрата. Если субстрат заменить ква­ зи-субстратом, в котором вместо С-концевой карбоксильной груп­

191

пы имеется амидная группа —CONbL, то фермент не оказывает

каталитического действия и но происходит изменения положения 248-го остатка тирозина.

Ьесьма уоедшельные и притом различные физико-химические данные, указывающие на то, что образование формепт-субстрат- пого комплекса сопровождается изменениями конформации молекулы фермента, были получены также для химотрнпсина,

т. е. для фермента, не требующего для своего действия коэн­ зима.

П родолж ит ельност ь прогревания, мин.

значительно отличается от «природного» субстрата данного фермепта, то он, по-видимому, может индуцировать в его активном цептре такую конформацию, которая, хотя и не абсолютно точно соответствует структуре данного субстрата, однако все же поз­ воляет образоваться соединению фермент—субстрат п в большей или меньшей степени обеспечивает протекание данной фермента­ тивной реакции. В этом случае мы будем иметь дело с так назы­ ваемым «плохим» субстратом.

Резюмируя изложенное, можно сказать, что активный центр фермента, принимающий участие в образовании соединения фер­ мент—субстрат и последующем каталитическом действии фермен­ та, ие имеет жесткой структуры и может несколько изменять ее под влиянием коэнзима и субстрата.

Хотя для большинства ферментов в настоящее время установ­ лены функциональные группы и активные центры, как это сдела­ но в отношении «сериновых» и многих других ферментов, все же следует подчеркнуть, что за каталитическую активность фермен­ та ответственна вся структура его молекулы в целом, а не только те или иные функциональные группы, не только активный центр.

192

Г л а в а 8

ПРИНЦИПЫ КЛАССИФИКАЦИИ ФЕРМЕНТОВ. НЕКОТОРЫЕ ПРЕДСТАВИТЕЛИ ОТДЕЛЬНЫХ КЛАССОВ

В настоящее время известно свыше 1000 различных фермен­ тов. Согласно новой классификации, разработанной специальной комиссией Международного биохимического союза и изложенной в книге «Номенклатура ферментов» (1966), все они разделяются

ной связи или, наоборот, присоединяют группы к двойным связям;

5) изомеразы, т. е. ферменты, катализирующие изомеризацию органических соединений;

6 ) лигазы или синтетазы. К этому классу принадлежат фер­ менты, которые катализируют синтетические реакции, сопровож­ дающиеся отщеплением остатков фосфорной кислоты от АТФ или аналогичного трифосфата.

Каждый из этих классов подразделяется на подклассы, а эти последние — на более мелкие группы.

1. Оксидоредуктазы

Оксидоредуктазы подразделяются на 14 подклассов в зависи­ мости от того, на какие соединения они действуют. Так, к перво­ му подклассу относятся оксидоредуктазы, которые действуют на группу СИ—ОН. Ко второму — оксидоредуктазы, которые дейст­ вуют на альдегидную или кетонную группу доноров. Оксидоре­ дуктазы третьего подкласса действуют на группу СН—СН2, чет­ вертого — на группу СН—NH2 и т . д . Эти подклассы, в свою оче­ редь, подразделяются на еще более мелкие группы. Каждый фермент имеет свой четырехзначный шифр. Первая цифра обозна­ чает класс, вторая подкласс, третья еще более мелкую группу ферментов (подподкласс). Четвертая цифра шифра обозначает конкретный фермент. Так, шифр 1.1.1.1 означает, что речь идет об алкогольдегидрогеназе. Этот принцип четырехзначного

7* 195

Рассмотрим некоторые из дегидрогеназ, содержащих НАД+ или НАДФ+ в качестве коферментов, например алкогольдегидрогеназу, лактатдегпдрогеназу, глнцеральдегидфосфатдегидрогеназу п глютаматдегидрогеиазу.

Названия этих ферментов, их субстраты и уравнения катали­ зируемых ими реакций приведены в табл. 3.

Т а б л и ц а 3

Некоторые дегидрогеназы, содержащие НАД+ н НАДФ+ в качестве коферментов

1.1.1.27L-Лактат: НАД — Лактатдегидроге- L-Лактат + НАД+=ші-

1.2.1.12D-Глпцеральдегид-З- Глицеральдегнд- D-Глицеральдсгид-З-

НАД — оксидоредуктаза. Он действует с НАД+ в качестве ак­ цептора водорода и окисляет спирты, в частности этиловый спирт. При этом в результате реакции образуется уксусный альдегид. Фермент катализирует следующую реакцию:

СНзСНгОН + НАД+ СНзСНО + НАД -И + И+.

Эта реакция играет важную роль в процессе спиртового бро­ жения, так как именно она является источником образования спирта.

196

ределения очень малых количеств спирта.

На рис. 60 приведена фотография кристаллической алкогольдегидрогеназы из печени лошади. Она имеет молекулярную мас­ су 84 тыс. и содержит четыре атома цинка в молекуле.

ление молочной кислоты. Шифр этого фермента: 1.1.1.27. Систе­ матическое название L-лактат: НАД — оксидоредуктаза.

Реакция, катализируемая этим ферментом, такова:

СНзСНОН-СООН + НАД+^СНзСО-СООН + НАД-Н 4- Н+.

Лактатдегидрогеназа имеет большое значение при молочно­ кислом брожении. Молочная кислота образуется в соответствии с этим уравнениемЭта реакция происходит также в слабой сте­ пени в хранящихся картофельных клубнях и в прорастающих

щая). В реакции, катализируемой этим ферментом, окислительно­ восстановительный процесс сопровождается присоединением остатка фосфорной кислоты. Субстраты этой реакции D-глицераль-

кислота и НАД-Н + Н+.

197