книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

феев современной биохимии и знзимологии Отто Варбург и многие

и биохимик Рихард Внлынтеттер со своими многочисленными учениками начинает большую серию работ, главной задачей ко­ торых было получение ферментов в высокоочищенном состоянии и выяснение их химической природы. При этом основным мето­ дом очистки ферментных препаратов был метод адсорбции из ра­ створа на различных адсорбентах, главным образом на гидрате окиси алюминия А1(ОЫ)3. Этот метод был в 1862 г. впервые ус­ пешно применен крупнейшим русским биохимиком А. Я. Да­ нилевским для отделения панкреатической амилазы от трипсина. Работы Вильштеттера с сотрудниками дали очень много для раз­ работки методов очистки ферментов, количественного определе­ ния их действия, характеристики отдельных ферментов и выяс­ нения их специфичности. Однако главная цель, которую ставил перед собой Внлыитеттер,— выяснение химической природы фер­ ментов — ие была достигнута. В своей фарадеевской речи, про­ изнесенной в 1926 г., Внлыитеттер пришел к заключению, что ферменты не могут быть отнесены ни к белкам, ни к углеводам, ии к какому-либо другому известному классу оргапических сое­ динений, а представляют собой какие-то особые вещества. Однако в том же 1926 г. была опубликована работа молодого американского биохимика Дж. Б. Самнера, в которой сообщалось, что ему уда­ лось из семян канавалии получить фермент уреазу в виде белковых кристаллов. Вследствие того огромного авторитета, которым поль­ зовался Внлыитеттер, работа Самнера не привлекла к себе доста­ точного внимания и более того — доставила ее автору ряд непри­ ятностей. Самнера упрекали в недостаточно чистом проведении экспериментов. Однако уже в 1930 г. Д. Нортроп выделил в виде белковых кристаллов пепсин, а в 1931 г. Д. Нортроп и М. Кунитц получили кристаллический трипсин.

Работы Самнера и Нортропа с сотрудниками открыли новую главу в развитии современной знзимологии. Они указали путь получения высокоочищенных кристаллических препаратов фер­ ментов и вместе с тем неопровержимо доказали их белковую при­

роду.

10

роль никотинамиднуклеотидов и рибофлавина в качестве со­

ставных частей ряда окислительно-восстановительных фер­ ментов.

Дальнейшее развитие препаративной химии ферментов, позволи­ ло установить участие в построении ферментов производных тиамина и пиридоксина, пантотеновой, фолиевой и липоевой кислот. В последние годы расшифрованы каталитические функции биотипа.

Новые методы выделения и очистки ферментов дали также воз­ можность показать, что многие ферменты содержат тот или иной металл, без которого они не могут действовать.

Важнейшую роль в развитии биохимии и эизимологни сыгра­ ли исследования, выяснившие каталитические функции различ­ ных нуклеотидов. Была установлена роль аденозинтрифосфата как источника фосфатных групп, участвующих в самых раз­ нообразных ферментативных реакциях, и как важнейшего соеди­ нения, в котором аккумулируется энергия, используемая клет­ кой в процессе жизнедеятельности.

Благодаря работам аргентинского биохимика Луиса Лелюара и ряда других исследователей была раскрыта роль ряда нуклеозиддифосфатов в качестве компонентов ферментных систеді, катализирующих превращения и синтезы различных углеводов и липидов.

Все эти работы позволили установить неразрывную связь меж­ ду обменом минеральных соединений, нуклеиновых кислот и нуклеотидов, с одной стороны, и каталитическими функциями фер­ ментов, с другой.

11

За время, прошедшее после окончания второй мировой войны, достигнуты замечательные успехи в расшифровке структуры фер­ ментов и в выяснении молекулярных механизмов их биосинтеза в клетке.

Классические исследования английского химика Ф. Сейгера, разработавшего методы расшифровки последовательности амино­ кислот в белках и с помощью этих методов раскрывшего структуру инсулина, дали мощный толчок развитию химии белков и позво­ лили выяснить строение ряда ферментов. Благодаря применению этих методов удалось полностью расшифровать первичную струк­ туру более 400 белков, в том числе многих ферментов, а также белковых компонентов целого ряда цитохромов. Важнейшую роль в расшифровке пространственной структуры белков и ферментов играет метод рентгеноструктурного анализа. На основе данных о молекулярной структуре белков в 1969 г. был впервые осущест­ влен химический синтез фермента рибонуклеазы. Это открывает блестящие перспективы синтеза высокоэффективных катализа­ торов для химической промышленности.

Наконец, в последние годы мы стали свидетелями крупнейших открытий, выяснивших молекулярный механизм ферментатив­ ного синтеза гигантских биополимеров — нуклеиновых кислот и их первостепенную роль в процессе биосинтеза белков. С. Очоа с сотрудниками открыли фермент полинуклеотидфосфорилазу, катализирующий синтез рибонуклеиновой кислоты и ее различ­ ных синтетических аналогов, а А. Корнберг с сотрудниками от­ крыли фермент ДНК-полимеразу, под действием которого проис­ ходит синтез ДНК и ДНК-подобных полимеров с молекулярной массой, достигающей 6-10°. Эти открытия послужили толчком для новой серии исследований, в результате которых была открыта целая группа ферментов, катализирующих синтез рибонуклеи­ новых кислот.

Применение синтетических полинуклеотидов строго опреде­ ленного состава при изучении процесса синтеза белка в бес­ клеточных ферментных системах дало возможность расшифровать роль нуклеиновых кислот в этом процессе и установить тесней­ шую связь между составом нуклеиновых кислот и составом син­ тезируемого белка, что явилось одним из наиболее выдающихся достижений естествознания XX столетия.

Все эти открытия приподняли завесу над самыми сокровенны­ ми тайнами живой материи и сулят блестящие перспективы для науки и практики.

12

Г л а в а 1

СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРОЕНИИ БЕЛКОВ

Ферменты представляют собой белковые вещества. Поэтому успехи в расшифровке структуры и механизма действия ферментов зависят прежде всего от успехов химии и физики белка, от успехов в области исследования строения белков. Белки являются биопо­ лимерами с молекулярной массой от 6 тыс. до миллиона и более, состоящими из остатков аминокислот.

В состав белков входят 22 различные аминокислоты, назы­ ваемые протеипогеппыми аминокислотами. Отдельные аминокис­ лоты в молекулах белков связываются при помощи п е п т и д- н о н с в язи, наличие которой в белках было обосновано и до­ казано главным образом работами Эмиля Фишера, развившего так называемую полппептидную теорию строения белка.

Согласно этой теории, которая сейчас общепринята, аминокис­ лоты соединяются между собой пептидной связью следующим образом:

дорода аминной группы одной аминокислоты и ОН-групиы кар­ боксила другой аминокислоты с выделением воды. Так, из алани­ на и глицина образуется соединение, которое содержит одну сво­ бодную карбоксильную группу, оставшуюся от молекулы алани­ на, и одну свободную аминогруппу, которая осталась от молеку­ лы глицина. Мы получили дипептид, т. е. соединение, содержащее остатки двух аминокислот. Если продолжить процесс присоеди­ нения остатков аминокислот и присоединить еще один остаток, то получим трипептид. Далее можно получить тетрапептид, пента­ пептид, полипептид.

Пептидная связь является основной связью в молекулах бел­ ков, и, следовательно, молекула белка представляет собой поли­ пептидную цепочку, имеющую на одном своем конце свободную аминпую группу, а па другом—свободную карбоксильную группу:

Пептидная связь

Остатки аминокислот

14

методы играют исключительно важную роль при изучении строения белков.

Одним из важных методов, который дал замечательные резуль­ таты, оказался метод определения N-концевых аминокислот, раз­ работанный Ф. Сейгером. Этот метод заключается в следующем. Известно, что если кипятить белок или полипептид с кислотой, то в результате гидролиза он распадается на составляющие его ами­ нокислоты.

Сенгер предложил перед гидролизом обрабатывать поли­ пептид или*£белок динитрофторбензолом. Это соединение, реа­ гируя со свободной аминогруппой полипептида или белка, обра­ зует с ней настолько прочное соединение, что потом, когда мы прогидролизуем этот белок или полипептид кислотой, все пептидные связи разорвутся, а связь между N-концевой аминокислотой и дииитрофенильиым остатком сохранится. Затем мы можем из полу­ ченного гидролизата тем или иным способом количественно вы­ делить динитрофенильное производное и определить, какая имен­ но аминокислота была N-концевой и сколько ее содержится в дан­ ном белке.

Реакция между дипитрофторбензолом и N-концевой аминокис­ лотой протекает следующим образом:

15

ное N - концевой аминокислоты

Для определения С-концевых аминокислот чаще всего поль­ зуются ферментом, который называется к а р б о к с и п е п ­ т и д а з о й. Этот фермент специфически расщепляет ту пептид­ ную связь, которая находится рядом со свободной карбоксильной группой. Если мы обработаем белок карбоксипептидазой, то этот фермент в первую очередь отщепит только одну аминокислоту от всей полипептидыой цепочки, а именно С-копцевую аминокис­ лоту. Если при этом в растворе мы обнаружим свободный валин, то можно быть уверенным в том, что С-концевой аминокислотой является валил.

Имеется ряд других методов определения N- и С-конце­ вых аминокислот, но наиболее зарекомендовали себя метод Сенгера и метод, основанный на использовании карбоксипеп­ тидазы.

Каким же образом методы определения N-концевых и С-кон­ цевых аминокислот могут быть применены для расшифровки пер­ вичной структуры полипептидной цепочки белковой молекулы? Это может быть сделано следующим образом. Во-первых, нужно определить, какая аминокислота является N-концевой. Это мож­ но сделать с помощью метода Сенгера. Параллельно проводят обработку белка карбоксипептидазой, которая последовательно отщепляет аминокислоты, находящиеся у С-конца полипептидной цепочки. В результате узнают, какая аминокислота является С- концевой.

При осторожном кислотном или ферментативном гидролизе белка мы можем постепенно отщеплять от пего те или иные амино­ кислоты или пептиды. Известно, что некоторые протеолитические ферменты расщепляют строго определенные пептидные связи, в которых участвует та или иная аминокислота, например тиро­ зин; другие, например трипсин, специфически действуют на пеп­ тидные связи, в образовании которых обязательно участвуют ар­ гинин или лизин.

16

Положим, Ито мы действуем иа белок шій полипептид фермен­ том, расщепляющим связи, в образовании которых обязательно участвует аргинин. Пусть мы имеем полипептид, в котором чет­ вертой аминокислотой справа является аргинин:

I

Тогда под действием указанного фермента мы получим трипептид, содержащий N-концевую аминокислоту, и остальную часть полипептидной цепочки. Далее этот трипептид и остальную часть мо­ лекулы можно подвергнуть анализу и определить их N- и С- концевые аминокислоты. Следовательно, путем сочетания посте­ пенного гидролиза с определением С-концевых и N-концевых ами­ нокислот можно расшифровать структуру полипептидной цепочки белка. Этим путем была расшифрована первичная структура ряда биологически активных белков. Так, например, было опре­ делено строение инсулина — гормона, выделяемого поджелу­ дочной железой человека и животных. Инсулин имеет молекуляр­ ную массу около 6 тыс. Сенгер, применив свой метод определения N-концевых аминокислот и карбоксипептидазу в сочетании с по­ степенным гидролизом, расшифровал строение инсулинов различ­ ных животных. Оказалось, что молекула инсулина представляет собой сочетание двух полипептидных цепочек, одна из которых содержит 21 аминокислотный остаток, а вторая — 30. Таким об­ разом, всего в состав молекулы инсулина входит 51 аминокислот­ ный остаток. Произведенная Сейгером расшифровка структуры инсулина — выдающееся достижение науки и важное доказа­ тельство справедливости полипептидной теории строения белка. Предложенная Сейгером структура инсулина блестяще подтвер­ дилась, поскольку удалось произвести полный химический син­ тез этого белка. Строение молекулы инсулина крупного рогатого скота показано на схеме 1. Таким же путем удалось расшифровать

Схема 1. Первичная структура молекулы инсулина крупного рогатого скота (по Ф. Сенгеру)

Глю-NHj — глютамин; Асп-NH. — аспарагин

17

структуру некоторых ферментов. Например, расшифрована пер­ вичная структура молекулы рибонуклеазы — фермента, расщеп­ ляющего рибонуклеиновую кислоту (схема 2).

Схема 2. Первичная структура молекулы рибонуклеазы (по У. Стейігу)

AcN — аспарагин; ГлК — глютамин; цифры на схеме — номера аминокислотных остатков

Из схемы видно, что молекула рибонуклеазы представляет собой длинную полипептидную цепочку, состоящую из остатков 124 аминокислот, в которой N-коицевой аминокислотой является лизии, а С-концевой — валин. Следует отметить, что нумерацию аминокислотных остатков начинают от N-копцевой аминокислоты.

Полностью расшифрована первичная структура лизоцима — фермента, содержащегося в яичном белке, слюне, некоторых ор­ ганах животных, некоторых микроорганизмах и растениях. Лизо­ цим (иначе он называется мурамидазой) вызывает растворение ряда бактерий, поскольку он расщепляет основное вещество, являю­ щееся главной составной частью их клеточной стенки. Кристалли­ ческий лизоцим яичного белка имеет молекулярную массу 14 386 и состоит из 129 аминокислотных остатков, образующих одну полипептиднуто цепь. Первичная структура молекулы лизоцима

представлена на схеме 3.

В настоящее время удалось также расшифровать первичную структуру некоторых гидролизующих белки ферментов, например химотрипсина. Этот фермент образуется в поджелудочной железе в виде неактивного предшественника — химотрипсиногена, ко­ торый затем в кишечнике превращается в активный химотрипсин. Первичная структура полипептидной цепи химотрипсиногена пол­

ностью раскрыта и показана на схеме 4.

Недавно расшифрована первичная структура фермента аспартат — аминотрансферазы, молекула которого состоит из 412 ами­ нокислотных остатков.

18

Схема 3. Первичная структура молекулы лизоцима из белка куриного яііца (по Р. Кеифплду и А. Лиу)

Цифры на схеме — номера аминокислотных остатков

Цнс-Гли-Вал- Про-Ал-Ил-ГлЫ- Про-Вал- Лей-Сер- Гл и-Лей-Сер- Арг-Ил-Вал-Ас N-Гли-Глю-

30 - 40

- Глю-Ал-Вал-Про-Глн-Сер-Трн-Про-Трн-ГлЫ-Вал-Сер-Лей-ГлМ-Ас-Лнз-Тре-Гли-Фен-Гнс-

S0 60

- Фен-Цис-Глн-Глн-Сср-Лей-Ил-АсЫ-Глю-АсГ'і-Трн-Взл-Вал-Тре-Ал-Ал-Гнс-Цнс-Глн-Вал-

70 80

- Тре-Трс-Сср-Ас-Вал-Вал-Вал-Ал-Глн-Г лю- Фен-Ас-ГлМ -Глн-Сер-Сер-Сер-Глю-Лнз-Ил-

90 100

** ГлІ^-Лнз-Лей-Лиэ-Ил- Ал-Лнз-Вал-Фен-Лнз-АсМ-Сер-Лнз-Тнр-АсМ-Сер-Лей-Тре-Ил-АсМ-

110 130

- AcN-AcN- Ил-Т ре-Лен-Лен-Лиз-Лей-Сер-Тре- Ал- Ал-Сер-Фен-Сер-ГлЫ-Тре-Вал-Сер-Ал-

- Три-Г лн-Лей-Тре-Арг-Тнр-Т ре- AcN-А л-А с N-Тре-Про-Ас- Apr- Лей-ГлЫ-Глі^-Ал-Сер- Лей-

170 tso

- Про-Лей-Лен-Сер-АсЫ-Тре-АсМ-Цис-Лнз-Лнз-Тнр-Три-Гли-Тре-Лнз-Ил-Лнз-Ас-Ал-Мет-

190 200

- Ил-Цнс-Ал-Глн-Ал-Сер-Г лн-Вал-Сер-Сер-Цис-Мет-Г ли- Ас-Сер-Гли-Глн-Про-Лей-Вал-

210 220

- Цнс-Лнз-Лнз-A cN -rлн-Ал-Трн-Тре-Лей-Вал-Гли-Ил-Вал-Сер-Три-Глн-Сер-Сер-Тре-Цис-

-Сер-Тре-Сер-Тре-Про-Гли-Вал-Тир-Ал-Арг-Вал-Тре-Ал-Лей-Вал-АсЫ-Трн-Вал-ГлМ-ГлГ^-

•Тре-Л ей-Ал-Ал-AcN

Днсульфидиые мостики: 1-122; 42-58; 136-201; 168-182; 191-220

Схема 4. Первичная структура молекулы химотрипсниогена крупного рогатого скота (по Ф. Шорму)