книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

Рис. 55. Модель молекулы фермента

Важнейшей составной частью активного центра является его «каталитически активный» участок, который вступает в непосред­ ственное взаимодействие с субстратом. Вместе с тем в активном центре фермента имеется так называемый контактный или якор­ ный участок, который обеспечивает специфическое сродство и образование соединения фермент — субстрат. Правда, нужно под­ черкнуть, что такое подразделение чрезвычайно условно и его следует применять лишь с большой осторожностью.

На рис. 55 схематически показано строение молекулы фермен­ та и положение в ней активного центра.

Рассмотрим вопрос о структуре активного центра на примере химотрипсина, молекула которого состоит из 246 остатков ами­ нокислот.

Выше мы уже указали, что при обработке химотрип­ сина ДФФ блокируется оксигруппа одного из остатков серина. Параллельно с ацилированием происходит снижение фермента­ тивной активности, и при связывании 1 моля диизопропилфторфосфата на 1 моль фермента она становится равной нулю. Следо­ вательно, тем каталитически активным участком активного^ центра химотрипсина, с которым реагирует субстрат, является серин, который соединен с одной стороны с аспарагиновой кислотой, а с другой — с глицином. При этом, хотя молекула химотрипсина содержит 26 остатков серина, для проявления каталитической активности фермента нужен только лишь один из них. В то же время простые пептиды, содержащие группировку Асп-Сер-Гли, реагируют с ДФФ по-иному, чем химотрнпсин. Таким образом, возникает мдісдь о том, что в активном центре химотрипсина в

*79

непосредственной близости от серина содержатся какие-то акти­ вирующие его аминокислоты.

Имеется ряд косвенных указании на то, что такой активирую­ щей аминокислотой является гистидин. Путем обработки соответ­ ствующими реактивами, блокирующими остатки гистидина, уда­ лось показать, что действительно неотъемлемой составной частью активного центра химотрипсхша являются два остатка гистидила. При этом, однако, важно подчеркнуть, что такая блокировка возможна лишь после обработки фермента мочевиной, разрываю­ щей водородные связи и нарушающей нативную конформацию всей молекулы фермента. Благодаря третичпой структуре моле­ кулы хпмотрппсина в активном центре фермента сближены один из остатков серина, играющий роль «каталитически активного» участка, и расположенные сравнительно далеко от него в полипептидной цепи остатки гистидина, выступающие в качестве акти­ вирующей аминокислоты. Такое сближение этих аминокислотных остатков возможно только в результате совершенно определенно­ го свертывания полипептидной цепочки и образования свойствен­ ной данному ферменту третичпой структуры.

Как известно, хнмотрппспн образуется в поджелудочной железе в виде каталитически неактивной формы фермента —

превращается в активный хпмотрипсин. Это превращеппе проис­ ходит под действием трипсина и заключается в гидролизе лишь одной пептидной связи между 15-м и :16-м аминокислотными

Рис. 56. Плоскостное изображение строения полішептпдиой цепочки химотрішсипогеиа (по Г. Нейрату)

Цифры показывают расположение аминокислотных остатков в полішептпдиой цепи; двойные черточки — дисульфидіше мостика

18U

остатками в полипептидной цепочке химотрипсиногена. Благодаря расщеплению в этом месте полипептидная цепь становится как бы менее стянутой, вследствие чего сближаются, могут взаимо­ действовать и образовать активный центр остатки гистидина, находящиеся в положении 40 и 57, и остаток серина, нахо­ дящийся в положении 195. Это видно на рис. 56, где дано пло­ скостное изображение полипептидной цепочки химотрипси­ ногена.

В результате расщепления этой единственной пептидной связи полипептидная цепь химотрипсина как бы расправляется и мо­ жет принять ту третичную структуру, ту конформацию, которая обеспечивает взаимодействие функциональных групп активного центра, необходимое для проявления каталитической активности фермента. Гипотетическая модель третичной структуры молекулы химотрипсиногена представлена на рис. 57.

Рис. 57 еще раз наглядно показывает всю сложность строе­ ния молекулы зимогена и активного фермента, свидетельствует о многообразии возможных взаимодействий отдельных функцио­

Как мы уже указывали в главе 6 , химотрипсин катализирует не только гидролиз пептидных связей в белках и пептидах, но н гидролиз сложноэфирной связи, т. е. обладает также эстеразным действием.

Зная, что активный центр молекулы химотрипсина содержит две имидазольные группы остатков гистидина и оксигруппу од­ ного из остатков серина, мы можем представить себе механизм эстеразного действия этого фермента в виде схемы 28.

Из схемы видно, что на первом этапе реакции (а) субстрат вхо­ дит в зону активного центра. Второй этап (б) заключается в нук­ леофильной атаке субстрата оксигруппой серина, в результате чего (в) образуется нестойкий промежуточный продукт. На сле­ дующем (г) этапе реакции происходит расщепление сложного эфира, возникает ацильное производное фермента. Далее (г и д) выделяется спирт, образовавшийся в результате расщепления эфира, и его место занимает молекула воды. Следующий этап реакции (е) заключается во второй нуклеофильной атаке, осу­ ществляемой ОН-группой воды.

В результате образуется новое нестойкое промежуточное сое­ динение (ж), которое распадается (з), причем выделяется кислота и регенерируется свободный фермент.

Следовательно, действие фермента заключается в образова­ нии в активном центре комплекса фермент — субстрат и последую­ щем перераспределении электронов в этом комплексе, приводя­ щем к реакции гидролиза сложного эфира.

181

Схема 28. Гидролиз сложного эфира химотрипсином и взаимодействие суб­ страта с активным центром фермента (по Г. Нейрату)

а — з — различные этапы реакции

Если фермент кроме белка (апофермеита) содержит кофермеит, то этот последний играет важнейшую роль в образовании соединения фермент—субстрат и протекании всей ферментативной реакции. Это может быть проиллюстрировано на примере участия тиаминпирофосфата (ТПФ) в декарбоксилироваиии пировино­ градной кислоты под действием пируватдекарбоксилазы. В тиа-

1«2

золовой части молекулы тиаминпирофосфата, являющегося коферментом пируватдекарбоксилазы, имеется четырехвалентный положительно заряженный атом азота, а у соседнего углеродного атома имеется отрицательный заряд. Перед тем как произойдет реакция декарбоксилирования, пировипоградная кислота взаимо­ действует с тиазоловым компонентом тиаминпирофосфата, при­ чем возникает соединение, в котором содержится четырехвалентпый положительно заряженный азот и остаток пировииоградиой кислоты. Так происходит образование комплекса фермент—субстрат.

Затем наблюдается перераспределение электронов в данном комплексе, он становится очень лабильным и легко распадается с образованием С02. После выделения С02 получается новый комплекс, который претерпевает ряд изменений, приводящих к созданию следующего комплекса, содержащего как бы прообраз уксусного альдегида (оксиэтилтиаминпирофосфат). Далее этот последний комплекс распадается с образованием свободного ук­

(Оксиэтилтиаминпирофосфат)

Какие выводы можно сделать из рассмотрения механизма ка­ талитического действия тиаминпирофосфата? Мы снова убе?кдаемся в том, что фермент, в данном случае через кофермент, преж­ де всего образует соединение с субстратом. Это соединение пре­ терпевает определенные изменения, приводящие к выделению С02 и образованию нового соединения, которое, в свою очередь, подвергается дальнейшим превращениям и дает оксиэтилтиамин­ пирофосфат, из которого в конечном счете образуется уксусный альдегид.

183

Окспэтилтпашштірофосфат играет роль «активного ацеталь­ дегида», взаимодействующего с липоевой кислотой в процессе окислительного декарбоксилировашш котокислот (см. стр. 322):

- гн

Активный ацетальдегид

Тнамшшпрофосфат является также кофермеитом траискетолазы (см. стр. 215). Б реакциях, катализируемых этим фермен­ том, он играет роль активного гликолевого альдегида:

СІЬОІ-І

—ТПФ

И

.Вторым примером роли кофермента во взаимодействии фер­ мента с субстратом и в осуществлении ферментативной реакции могут служить реакции переамипироваппя, катализируемые аминотрапсферазамн. Первые работы по выяснению механизма дей­ ствия амппотрапсфераз были проведены американским биохи­ миком Э. Снеллом, который исследовал реакцию пеферментатнвного взаимодействия пирпдоксаля с аминокислотами. Он нагревал при 1 0 0 ° ппрндоксаль с той или иной аминокислотой и показал, что при этом образуется пиридоксамин. Эта реакция идет следующим образом:

Пиридоксаль, реагируя в растворе с какой-нибудь аминокис­ лотой, дает пиридоксамин и кетокислоту, соответствующую ис­ ходной аминокислоте, поскольку аминная группа перемещается на место альдегидной группы пирпдоксаля. Если образующийся

вэтой реакции пиридоксамин, в свою очередь, кипятить в раство­ ре с какой-то кетокислотой, предположим с пировиноградной, то

врезультате реакции пиридоксамин передаст свою аминогруппу •кетокислоте и из пировииоградной кислоты образуется а-аланин

ирегенерируется пиридоксаль, который в этой реакции играет роль катализатора.

184

Работы Снелла по химическому взаимодействию пиридоксаля с аминокислотами и пиридоксамина с кетокислотами послужили основанием для соображений о механизме реакции ферментатив­ ного переаминирования.

Однако при исследовании химической природы амииотранс-

Если мы представим себе реакцию ферментативного переами­ нирования при участии аминотрансферазы и активной группы в виде пиридоксальфосфата, то мы должны написать следующее уравнение:

1) Фермент — ШТФ -ф ампігокпслотаі фермент — ПМФ -j- кетокпслотаі.

Далее комплекс фермент — лиридоксаминфосфат реагирует с новой кетокислотой (кетокислотой 2 ), и происходит реакция:

2) Фермент — ПМФ + кѳтокислотаз ^ фермент — ПЛФ аминокислота^.

Таким образом, реакция ферментативного переаминирования завершена. Теперь мы можем написать суммарную реакцию:

Лмпнокислотлі -|- кетокислотаз ^ кетокпслотаі + аминокислота*.

Взаимные превращения пиридоксальфосфата и пиридоксаминфосфата при ферментативном переамиыироваыии очень тщатель­ но изучены. Доказано, что действительно при реакции фермен­ тативного переаминирования происходит превращение соедине­ ния пиридоксальфосфата с белком в соединение пиридоксаминфосфата с белком.

Общую теорию механизма действия аминотрансфераз и дру­ гих ферментов, содержащих пиридоксальфосфат, разработали А. Е. Браупштейи и М. М. Шемякин. Согласно этой теории, пиридоксалъфосфат, соединенный с белком, реагируя с аминокисло­ той, образует соединение типа Шиффова основания. Эта реакция протекает следующим образом:

Шпффово основание (I) (альдимнн)

185

Мы можем изобразить эту последнюю реакцию в виде следую­ щего уравнения:

Фермент —ПМФ + ЩСОСООН ^ фермент — ПЛФ + RaCHNtbCOOH.

Таким образом, фермент регенерируется и возникает новая аминокислота, соответствующая второй кетокислоте.

Теория Браунштейна и Шемякина получила широкое распро­ странение. Одновременно с этими учеными аналогичную гипотезу действия пиридоксалевых ферментов предложил Снелл, который исходил из модельных опытов по иеферментативному переаминированию. Поскольку реакции иефермеитативного переаминирования и другие превращения аминокислот под действием пиридоксаля стимулируются металлами, Снелл предположил, что металл должен участвовать и в соответствующих ферментативных реак­ циях. Он показал, что роль металла в таких реакциях связана с тем, что металл вступает в комплекс с иминами, образующимися из аминокислот и пиридоксаля, и повышает реакционную способ­ ность этих иминов.

Оказалось, однако, что высокоочищениые препараты аминотрапсфераз и ряда других фосфопиридоксалевых ферментов не содержат металлов и не требуют их для своего действия. В связи с этим Снелл пересмотрел свою гипотезу и пришел к заключению, что ту роль, которую в реакциях модельного пиридоксалевого ка­ тализа играет металл, в ферментативных превращениях выпол­ няет белок пиридоксалевого фермента. При таком изменении ги­ потеза Снелла практически не отличается от представлений Бра­ унштейна и Шемякина.

За последнее время выяснены некоторые новые детали меха­ низма ферментативного переаминирования. В схемах, которые предложили Снелл, а также Браунштейн и Шемякин, принима­ лось, что в аминотрансферазах карбонильная группа пиридоксальфосфата С = О свободна и именно она вступает во взаимо­ действие с аминокислотой, образуя соединение типа Шиффова основания. Однако спектрофотометрические и другие исследова­ ния показали, что эта карбонильная группа в пиридоксалевых ферментах не свободна, а соединена иминной связью с E-NH2- группой остатка лизина, содержащегося в молекуле ферментного белка. В связи с этим возникает вопрос: каким же образом пиридоксальфосфат соединяется с аминокислотой? Очевидно, не пу­ тем конденсации с выделением молекулы воды, а путем реакции замещения, при которой NH2-rpynna аминокислоты-субстрата вытесняет е-Ш-І2-группу лизииового остатка фермента из имин­ ной связи с пиридоксальфосфатом (Браунштейн; Снелл). Это со­ гласуется с тем, что в неферментативных реакциях Шиффовы ос­ нования типа I образуются из аминокислот при взаимодействии с производными альдегидов и кетонов, содержащими двойную связь С = N (иминами, оксимами, гидразонами), легче, чем со свободными карбонильными соединениями.

187