книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

углубления в тех участках, где происходит образование соедине­ ния фермент—субстрат. Мы видим, что это соединение возникает не в любом месте молекулы фермента, а лишь в двух определен­ ных ее точках.

К одной из этих точек присоединяется часть молекулы А , а к другой — часть молекулы В. При этом происходит растяжение связи между А и В, перемещение электронов и в конце концов разрыв этой связи, сопровождающийся присоединением водорода воды к одной части молекулы и гидроксила воды к другой ее части:

AB + ШО ^ НОЛ + ВН.

Если мы имеем обратную реакцию, то происходит сближение продуктов гидролиза, они становятся ближе друг к другу на по­ верхности молекулы фермента. Вновь наблюдается перераспре­ деление электронов и синтезируется вещество А — В.

Теория «дыбы» была выдвинута исходя из идей, развивавших­ ся Гансом Эйлером. Согласно Эйлеру, гидролитический фермент связывается с молекулой субстрата в двух точках и, следова­ тельно, на поверхности молекулы фермента имеются две точки, в которых происходит присоединение субстрата. Идея Эйлера подтвердилась в целом ряде случаев.

Хорошим примером для иллюстрации этого положения явля­ ется действие фермента аргиназы. Аргиназа катализирует гид­ ролиз аргинина с образованием мочевины и орнитина:

то аргиназа совершенно не расщепляет его.

Хотя гидролитическое расщепление происходит на другом конце молекулы, замена атома водорода в карбоксиле аргинина метальным радикалом не позволяет протекать этой реакции. Таким образом, для осуществления реакции гидролиза необходимо наличие свободного карбоксила аргинина.

Если соединить две молекулы аргинина за счет карбоксила од­ ной молекулы и аминной группы второй молекулы, мы полу-

169

чим дипептид — арі'иниларгинин. Оказывается, что в этом случае аргиназа не расщепляет первую половину молекулы дипептида и действует лишь на вторую половину, именно на ту, которая содержит свободную карбоксильную группу. При действии арги­ назы на аргиниларгинин, поскольку свободен только один кар­ боксил, образуется лишь половинное от теоретического количест­ во орнитина и мочевины. Совершенно очевидно, что в реакции участвует не только гуанидиновый остаток молекулы аргинина, но и тот ее конец, который содержит карбоксильную группу.

Каким образом мы можем выявить те или иные функциональ­ ные группы фермента, участвующие в проявлении его каталити­ ческой активности?

Во-первых, это можно сделать путем применения различных ингибиторов ферментов. В качестве примера таких ингибиторов можно пазвать уже упоминавшуюся нами (стр. 144) синильную кислоту IICN и ее соли — цианиды. Синильная кислота отравляет окислительно-восстановительные ферменты, которые содержат в своем составе медь или железо. Особенно хорошим примером та­ кого действия сппильной кислоты является ингибирование ею цитохромокспдазы, играющей важнейшую роль в клеточном ды­ хании.

Второй пример специфического ингибитора — диэтилдитиокарбамат — соединение, которое ингибирует ферменты, содер­ жащие в своем составе медь, например о-дифенолоксидазу (полпфенолокспдазу).

Действие этих ингибиторов показывает, что в данном фермен­ те, например полпфенолоксидазе или цптохромоксидазе, может содержаться определенный металл, медь или железо.

Второй способ выявления активных групп заключается в том, что из молекулы фермента можно постепенно, путем осторожного гидролиза под действием соответствующих ферментов удалить ряд аминокислотных остатков, входящих в состав молекулы дан­ ного белка. При этом активность в значительной степени сохра­ няется т. е. активность данного фермента связана не со всей его молекулой, а с какой-то ее частью. Например, путем осторожного гидролиза можно удалить значительную часть аминокислотных остатков из молекулы дрожжевой енолазы без снижения катали­ тической активности фермента.

Следующий метод изучения активных групп ферментов — это их химическая модификация — окисление, блокировка, замеще­ ние карбоксильной группы на эфирную и т. д. Особенно широко применяется блокировка активных групп специфическими реакти­ вами. Так, например, мы уже указывали, что иа SH-групны фер­ ментов имеется специфический реактив — п-хлормеркурибензоат.

Другой специфически блокирующий реактив, который сейчас широко применяется в энзимологии,— диизопропилфторфосфат (ДФФ). Он специфически связывается с оксигруппами содержа­ щегося в белке серина. Благодаря использованию этого ингиби­

170

тора удалось достигнуть весьма важных результатов, о которых будет сказано несколько ниже.

Когда речь идет об активных группах ферментов, то, конечно, имеются в виду как активные группы кофермептов, так и актив­ ные группы апоферментов. Так, например, в коэнзиме А активной группой, к которой присоединяются различные радикалы, напри­ мер ацетил, является SH-группа меркаптоэтиламина.

Хотя для действия многих ферментов необходимы активные группы в составе кофермента, однако особо важное значение име­ ют активные группы самого белка: при соединении кофермента со специфическим белком наблюдается резкое возрастание ката­ литической активности.

В настоящее время достигнуты значительные успехи в облас­ ти изучения ферментных белков. Наиболее яркими примера­ ми этих достижений являются результаты исследования фермен­ тов лизоцима и рибонуклеазы (РНК-азы). Мы уже отмечали ра­ нее (стр. 18), что первичная структура рибонуклеазы, лизоцима и химотрипсина полностью расшифрована.

Рибонуклеаза катализирует, расщепление рибонуклеиновой кислоты так, как это показано на схеме 26. Молекулярная масса кристаллической рибонуклеазы равна 13 683. Ее молекула пред­ ставляет собой белок, состоящий из 124 аминокислотных остатков (см. схему 2). N-копцевой аминокислотой рибонуклеазы является лизин, а С-концевой — валин. В молекуле рибонуклеазы имеются четыре дисульфидпые связи. Они изображены на схеме в виде черных перемычек. Расшифровка первичной структуры рибонук­ леазы и дальнейшее изучение свойств этого фермента показали следующее очень важное и интересное обстоятельство. Установ­ лено, что полипептидная цепочка рибонуклеазы заспирализовапа не более чем на 5%. Таким образом, молекула этого фермента практически почти лишена вторичной структуры, и ее упаковка в пространстве осуществляется благодаря третичной структуре.

Важно отметить, что если мы расщепим пептидную связь меж­ ду 2 0 и 2 1 аминокислотным остатком рибонуклеазы, т. е. связь между аланином и серином, то это совершенно не скажется на ферментативной активности рибонуклеазы. Далее, если удалить G-концевой аминокислотный остаток, а именно валин, а это мож­ но сделать с помощью карбоксипептидазы, то активность рибо­ нуклеазы не снизится. В данном случае мы видим, что удаление С-концевой аминокислоты не сказывается на активности фермента.

От каких же химических группировок зависит каталитическая активность рибонуклеазы?

Длявыяснения этого вопроса была применена монойодуксусиая кислота CH2 JCOOH, которая блокирует остатки аминокис­ лоты гистидина. В молекуле рибонуклеазы имеются два остатка гистидина — один в положении 12 и другой в положении 119, т. е. один в начале, а другой в конце полипептидной цепочки. Если с помощью монойодуксусной кислоты блокировать эти два гисти-

171

І7 2

диновых остатка рибонуклеазы, то это приведет к полной потере ферментативной активности. Блокировка моиойодацетатом гистидиновых остатков в молекуле фермента происходит следующим образом:

НС—NI-I

ОО

СІ-Із—соо-

В результате обработки рибонуклеазы моиойодацетатом вы­ яснилось следующее важное обстоятельство. Если блокировать 12-й гистидиновый остаток, то это препятствует замещению 119-го остатка, и наоборот. Отсюда был сделан вывод, что эти два гистидиновых остатка расположены в пространстве недалеко один от другого и что, следовательно, молекула рибонуклеазы свернута таким образом, что 12-й и 119-й аминокислотные остатки поли­ пептидной цепочки оказываются в непосредственной близости один от другого.

Если обработать рибонуклеазу динитрофторбензолом, кото­ рый реагирует со свободными аминогруппами, то можно связать свободную аминогруппу остатка лизина, находящегося в поло­ жении 41. При такой обработке также происходит полная потеря ферментативной активности рибонуклеазы.

Мы указывали, что в молекуле рибонуклеазы имеются четыре дисульфидиые связи. Если их восстановить, то возникнет восемь сульфгидрильных групп (SH-групп), причем активность рибону­ клеазы полностью теряется. По-видимому, дисульфидные группы связывают между собой в пространстве отдельные участки поли­ пептидной цепочки рибонуклеазы. Это очень важное и интересное наблюдение, поскольку известно, что для проявления фермента­ тивного действия многих других ферментов, например дегидро­ геназ, SH-группы являются как раз совершенно необходимыми:

173

Примером действия SH-группы, входящей в состав кофермента, является сулъфгидрилыіая группа коэнзима А.

Очень хорошим примером значения SH-групп для действия фермента является лактатдегидрогеназа.

Если блокировать SH-группы этого фермента с помощью спе­ цифических реактивов, например д-хлормеркурибензоата, то фер­ мент будет постепенно инактивироваться. Установлено, что моле­ кула мышечной лактатдегидрогеназы содержит 14 SH-групн. Если постепенно блокировать этот фермент, используя разные количества н-хлормеркурибензоата, можно построить кривую, изображенную на рис. 54.

Рис. 54. Влияние блокировки SH-групп па активность лактатдогпдрогспазы (по Г. Пфлеіідсреру)

О 7 2 3 4 5 В 7 3 9 10 111213 Количество SH -групп на моль

Как видно из этого рисунка, при связывании трех из четыр­ надцати SH-групп лактатдегидрогеназы активность фермента снизится примерно на 90%. Достаточно блокировать эти три SHгруппы фермента, чтобы практически полностью его инактивиро­ вать. Таким образом, получается, что именно те три SH-группы, которые наиболее легко реагируют с п-хлормеркурибензоатом, играют особо важную роль в проявлении каталитической актив­ ности лактатдегидрогеназы.

До сих пор неясно, какое именно значение имеют эти три SH-группы: необходимы ли они для образования соединения фермент — субстрат, или они поддерживают третичную струк­ туру белка. Для разрешения этого вопроса необходимы даль­ нейшие исследования. Во всяком случае, ыа примере лактат­ дегидрогеназы мы видим, что ие все SH-группы в молекуле фер­ мента равноценны. Некоторые из них особенно важны для про­ явления каталитической активности фермента.

Возникает вопрос: имеется ли какая-то общность в строении белковой части различных ферментов? Неоднократно делались попытки установить такую общность. В этом отношении очень интересной группой являются так называемые сериновые фер­ менты. Эта группа ферментов угнетается определенными ингиби­ торами — нервными ядами. Среди этих ингибиторов особенно важным и наиболее часто применяемым является диизопропилфторфосфат. Это соединение было открыто во время второй миро­ вой войны в связи с работами по изысканию средств защиты от кожнонарывных отравляющих веществ, например люизита. Строение диизопропилфторфосфата таково:

176

! Нз(-

сопоставления формул ортофосфорной кислоты и диизопропилфторфосфата, последний представляет собой производное ортофосфорной кислоты, у которой два водородных атома в гидро­ ксильных группах замещены остатками изопропила, а одна гид­ роксильная группа замещена атомом фтора. Это соединение ока­ залось исключительно ценным ингибитором в эпзимологии. Ряд ферментов, совершенію разных по своему действию, полностью инактивируется ДФФ. Его применение позволило расшифровать структуру многих ферментов. ДФФ совершенно специфически связывается с гидроксильной группой одного из остатков серина, содержащихся в молекуле белка. При этом образуется очень прочное соединение. Если обработанный таким способом белок прогидролизовать, то все связи разрываются, кроме связи серина с ДФФ. В результате можно выделить вещество, которое пред­ ставляет собой остаток серина, связанный с остатком дпизопронилфторфосфата. Важно отметить, что ДФФ реагирует только лишь с одним из многих остатков серина, содержащихся в моле­ куле фермента.

Исследование последовательности аминокислотных остатков, расположенных в непосредственной близости к остатку серина, реагирующего с ДФФ, дало следующие результаты (по Д. Кошленду):

177

Как известно, трипсин и химотрипсин — это Протеолитические ферменты, содержащиеся в пищеварительном тракте. Тромбин — фермент, участвующий в процессе свертывания крови и катализи­ рующий превращение фибриногена в фибрин. Панкреатопептидаза Е — протеолитический фермент, действующий на коллагены, т. с. белки, которые входят в состав сухожилий. Из приведен­ ных данных видно, что у этих четырех ферментов рядом с «актив­ ным остатком» серина находятся остатки одних и тех же ами­ нокислот — аспарагиновой кислоты и глицина.

Печеночная эстераза (алиэстераза) принадлежит к фермен­ там, расщепляющим сложпые эфиры. Здесь уже несколько иная последовательность аминокислот — около серина вместо аспара­ гиновой имеется глютаминовая кислота, а вместо глицина — аланин. Псевдохолинэстераза вырабатывается организмом жи­ вотных и человека. Она катализирует расщепление ацетилхолина и участвует в передаче нервного возбуждения. У нее последова­ тельность аминокислот рядом с серином такая же, как у алиэстеразы.

Щелочная фосфатаза—фермент, расщепляющий эфиры фос­ форной кислоты и, как показывает название, действующий в ще­ лочной среде. . В ее молекуле последовательность аминокислот около серина такая же, как у двух предыдущих ферментов.

Субтплопептидаза — протеолитический фермент, выделяемый сенной палочкой Bacillus subtilis. В этом ферменте рядом с се­ рином расположены остатки треонина и метионина.

Фосфоглюкомутаза катализирует перенос остатков фосфорной кислоты. Рядом с серином в ее молекуле расположены остатки аланипа и гистидина.

Таким образом, у всех этих ферментов, совершенно различных по характеру действия, оксигруппа серина играет решающую роль в проявлении их каталитической активности, причем для некоторых ферментов аминокислотные остатки, окружающие се­ рин, одинаковы. Однако лишь для некоторых весьма небольших групп ферментов, сходных по характеру своего действия, как, например, для алиэстеразы, псевдохолинэстеразы и щелочной фосфатазы, это «окружение» одинаково.

Тот факт, что оксигруппа серина необходима для действия многих ферментов, удалось доказать еще и другим методом. Если путем особой химической обработки удалить из белка оксигруп­ пу серина, то активность фермента полностью утрачивается.

Изучение различных функциональных групп, необходимых для проявления каталитического действия ферментов, и сопоставле­ ние получаемых данных с результатами исследования первичной, вторичной и третичной структуры ферментных белков привело к представлению об а к т и в н о м ц е н т р е ф е р м е н т а , т. е. той комбинации различных химических группировок в молекуле фермента, благодаря которой осуществляется его каталитическое действие.

178