книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

Можно привести и другие примеры множественной специфич­ ности ферментов. Нужно, однако, заметить, что соотношение различных активностей у ферментов, обладающих множествен­ ной специфичностью, может весьма существенно изменяться под влиянием присутствующих в реакционной смеси веществ, напри­ мер ионов различных металлов (см. стр. 1 1 0 ).

Говоря о специфичности протеолитических ферментов, необ­ ходимо остановиться на реакциях транспептидации, т. е. фер­ ментативном переносе аминокислотных остатков от одного сое­ динения к другому.

Установлено, что такие протеолитические ферменты, как па­ пайи или химотрипсин, которым до сих пор приписывалась только лишь гидролитическая функция, катализируют также межмо­ лекулярный перенос остатков аминокислот (реакция транспеп­ тидации) .

Так, например, при действии на смесь бензоилтирозилглицииамида и глицинамида, меченного изотопом азота N15, эти ферменты катализируют замещение остатка глицинамида в молекуле беизоилтирозилглицинамида остатком меченого глицин­

М І Ц - І - С Щ — С О — N1-1-2 J

R

С цН з— С О — N Н — С Н — С О — j N 15H — СН-2— С О — N Н ~ j + N i b — CTU — С О — N i b

Из листьев капусты выделен фермент, катализирующий пере­ нос остатков глицина с различных пептидов на те или иные ами­ нокислоты. Под действием этого фермента идут, например, сле­ дующие реакции:

Как показали исследования, путем ферментативного переноса остатков аминокислот могут быть синтезированы весьма слож­ ные полипептиды.

159

Закапчивая рассмотрение вопроса о специфичности действия протеолитических ферментов, необходимо еще раз подчеркнуть, что препараты высокоочищештых протеаз, поскольку они рас­ щепляют совершсиио определенные пептидные связи, нашли ши­ рокое применение в химии белков при выяснении их первичной структуры.

Каким образом можно решить вопрос, имеем ли мы дело с одним ферментом, действующим на два различных субстрата, или же со смесью двух разных ферментов?

Прежде всего необходимо, чтобы фермент был получеи в высокоочищениом виде, желательно в кристаллическом состоянии. Далее должны быть применены три основных критерия.

Первый критерий — результаты фракционирования фермент­ ного препарата. Фракционирование можно осуществлять раз­ личными способами. Наиболее часто применяются: а) осаждение сернокислым аммонием, б) хроматография на колонках из геля трикальцийфосфата, в) хроматография на колонках из диэтиламиноэтилцеллюлозы, карбокснметилцеллюлозы или ДЭАЭ-се- фадекса.

Если при фракционировании на колонке не удается разделить две активности, свойственные данному ферментному препарату, то весьма вероятно, что мы имеем дело с одним ферментом, об­ ладающим двумя активностями. Важно также, как меняются эти две активности по мере очистки фермента при фракциониро­ вании. Если они повышаются параллельно, то это тоже свидетель­ ствует в пользу наличия одного фермента.

Второй критерий — это постоянство отношения величин ак­ тивности при инактивации ферментного препарата теплом или ингибиторами. Пусть мы имеем ферментый препарат, обладаю­ щий активностью А и активностью Б, и соотношение этих ак­ тивностей равно 1/1о- Если инактивировать фермент на 50%, то соотношение обеих активностей должно остаться постоянным в том случае, если обе активности принадлежат одному ферменту.

Третий критерий — совпадение константы ингибитора / 4 при конкурентном торможении: это говорит о том, что мы имеем дело с одним ферментом, обладающим двумя активностями. Важно подчеркнуть, что все эти три критерия нужно использовать сов­ местно.

Заканчивая рассмотрение вопроса о специфичности фермента­ тивного катализа, мы должны подчеркнуть, что в ее основе лежит соответствие строения фермента и субстрата. В своей работе, посвященной гидролизу различных глюкозидов ферментами, Эмиль Фишер писал: «Если воспользоваться образным выраже­ нием, то я бы сказал, что для того чтобы осуществилось хими­ ческое взаимодействие, энзим и глюкозид должны подходить друг к другу как ключ к замку». Эта идея о структурном соответствии фермента и субстрата лежит в основе всех современных представ­ лений о специфичности действия ферментов. Огромный экспери­

160

ментальный материал, накопленный эпзимологией, свидетельст­ вует о том, что специфичность ферментативного катализа определя­ ется комплементарностьто строения фермента и субстрата, т. е. структурной (геометрической) и электронной («химической») взаи­ модополняемостью молекулы субстрата и молекулы фермента. Можно привести целый ряд примеров, показывающих, как по мере модификации строения молекулы субстрата и отклонения ее от комплементарности «хороший» субстрат может превращаться в «плохой» и далее, при условии сохранения достаточного сродства к ферменту, в конкурентный ингибитор или же в соединение, по отношению к которому фермент совершенно индифферентен.

Экспериментальное изучение специфичности действия фермен­ тов проливает свет па те особенности их структуры, от которых зависят высокая эффективность и специфичность ферментатив­ ного катализа, и на механизм действия ферментов.

Л и т е р а т у р а

Ераунштеііѣ А. Е., Карпейский М. Я . Структурные предпосылки специфич­

ности и эффективности фермептатпвпого каталпза.— Журн. Всес. хлм. об-ва им. Д. И. Менделеева, 1971, 16, № 4, 362.

Fischer Е. Einfluss der Konfiguration auf die Wirkung der Enzyme.— Ber.

Dtsch. chem. Ges., 1894, 27, 2985.

Pishbein W. N., Winter T. S ., Davidson J. D. Urease catalysis. I. Stcchiometry, specificity and kinetics of a second substrate: hydroxyurea.— J. Biol. Chem., 1965, 240, 2402.

Hirschmann H. Newer aspects of enzymatic stereospecifity.— In «Compre­ hensive biochemistry». Edited by M. Florkin and E. Stotz, Amsterdam, Elsevier Publ. Co, vol. 12, 1964, p. 236.

Pazur J. II., Kleppe K. The oxidation of glucose and related compounds by glucose oxidase from Aspergillus niger.— Biochemistry, 1964, 3, 578.

Г л а в а 7

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

При рассмотрении вопроса о механизме действия ферментов-, мы прежде всего исходим из предположения о том, что действие фермеита осуществляется благодаря образованию соединения фермент — субстрат. Доказать экспериментально это предположе­

пиидля изучения образования соединения фермент — субстрат было разработано далее многими другими биохимиками и играет ог­ ромную роль при изучении кинетики и механизма ферментатив­ ных реакций.

В настоящее время, благодаря работам Б. Чанса, предложены весьма чувствительные методы для спектрофотометрического изу­ чения кинетики ферментативных реакций и процесса образования соединений фермент — субстрат.

1(52

метрического метода было изу­ чено также образование соединения фермент—субстрат для ряда

флавиновых ферментов — дегидрогеназ, содержащих в качестве кофермента не НАДД а флавин.

Важные данные о течении ферментативной реакции и об обра­ зовании ее промежуточных продуктов могут быть получены при низкотемпературной спектрофотометрии в жидких средах, не замерзающих при температурах до —80°. В качестве таких сред используются, например, смеси метанол — вода, этиленгликоль — вода, диметилформамид — вода, диметилсульфоксид — вода.

Другой метод — метод равновесного диализа. Этот метод за­ ключается в следующем. Поскольку фермент обязательно обра­ зует в каком-то месте своей молекулы (там, где находятся опре­ деленные химические группы) соединение с субстратом, за образованием этого соединения можно проследить, используя кон­ курентные ингибиторы.

Для этого диализуют смесь фермента и конкурентного инги­ битора, которым до диализа дали некоторое время для того, чтобы они могли вступить во взаимодействие друг с другом. При этом диализе удаляются свободные молекулы ингибитора. Но те его молекулы, которые соединились с ферментом, при диализе не удаляются. Зная молекулярный вес фермента и молекулярный вес ингибитора, мы можем, после того как закончится выход из мешочка свободных молекул ингибитора, проанализировать жид­ кость, в которой образовалось соединение фермент—ингибитор, и рассчитать, сколько молекул ингибитора присоединилось к мо­ лекуле фермента. Таким образом, можно определить, сколько так называемых акцепторных площадок имеет фермент. Если к

6* 163

Рис. 53. Кристаллический комплекс оксидазы D-аминокислот п D-аланпна (по К. Яги и Т. Озава)

ми спирта. Зная молекулярную массу фермента и субстрата, рас­ считали, сколько молекул спирта присоединилось к одной моле­ куле алкогольдегидрогеназы.

Наконец, в 1962 г. японским биохимикам К. Яги и Т. Озава удалось получить в кристаллическом состоянии соединение фер­ мент —субстрат для оксидазы D-аминокислот. Как мы уже указы­ вали (стр. 150), этот фермент катализирует реакцию окислитель­ ного дезаминирования D-аминокислот. Так, например, под его действием из б-аланина образуются аммиак и пировииоградная кислота:

Кристаллический фермеит-субстратный комплекс оксидазы D-аминокислот и D-аланииа, изображенный на рис. 53, может быть получен лишь в анаэробных условиях: в присутствии кислорода он немедленно распадается на фермент и продукты реакции. Воз­ никает вопрос: благодаря каким связям образуется соединение фермент — субстрат? Связи могут быть разнообразны и зависят в первую очередь от химической природы субстрата. Это прежде всего обычные ковалеитные химические связи. Когда в субстрате имеются заряженные группы, образование соединения фермент — субстрат происходит благодаря электростатическому взаимодей-

1155

ствию и возникновению ионных связей между положительно за­ ряженными группами субстрата и отрицательно заряженными группами фермента и наоборот.

Если субстрат ие содержит заряженных групп, как это, на­ пример, наблюдается у сахаров, то присоединение фермента к суб­ страту происходит благодаря образованию водородных связей. Наконец, в целом ряде случаев, например при воздействии фер­ мента на углеводородные цепи той или иной длины, субстрат сое­ диняется с ферментом благодаря гидрофобным взаимодействиям.

Воснове всех теорий, объясняющих механизм действия фер­ ментов, как мы уже отмечали ранее (см. стр. 134), лежит представ­ ление о том, что фермент снижает энергию активации данной реак­ ции. Он изменяет молекулу субстрата таким образом, что энер­ гия, которую нужно придать этой молекуле для того, чтобы она прореагировала, понижается. Каким же образом происходит такое снижение энергии активации субстрата?

Всамой общей форме можно сказать, что это происходит бла­ годаря изменению конфигурации молекулы субстрата. Благодаря воздействию соединенного с субстратом фермента осуществляется как бы деформация молекулы. Молекула субстрата поляризуется, электроны в ней перераспределяются, что и приводит к изменению расположения электрических зарядов. На это в свое время указывал великий русский химик Д. И. Менделеев. В своих «Основах химии», характеризуя каталитические, или, как он их

называл, контактные явления, Д. И. Менделеев писал: «Должно думать, по моему мнению, что на точках прикосновения тел при контактных явлениях изменяется состояние внутреннего движе­ ния атомов в молекулах, а оно определяет химические реакции».

Менделеев подчеркивал, что под влиянием катализатора про­ исходит изменение в структуре молекулы субстрата, происходит поляризация и перераспределение электрических зарядов.

Однако сказанное справедливо для катализа вообще. Если же мы переходим к ферментативному катализу, то здесь надо помнить три основных специфических отличия ферментативного катализа от неферментативного. Первое отличие — исключитель­ но высокая специфичность ферментативного катализа, совершен­ но несвойственная катализу неорганическому и неферментатив­ ному. Вторая особенность ферментативного катализа заключа­ ется в том, что фермеиты, как мы много раз говорили, действуют при сравнительно очень мягких условиях внешней среды: темпе­ ратуры, pH, давления. И наконец, третья особенность, которую нужно учитывать,— это исключительно высокая молекулярная активность ферментов.

Рассмотрим высокую эффективность действия фермента по сравнению с неорганическими катализаторами. Это можно сде­ лать на примере реакции разложения перекиси водорода на воду и кислород. Ниже приведены данные, которые ясно показывают, насколько выше эффективность ферментативного катализа по

166

кислоты. Постепенно усложняя молекулу амина, мы, наконец, до­ ходим до витамина Bj. Его пнруватдекарбоксилазная активность довольно велика. Однако она несравненно ниже активности са­ мой пируватдекарбоксилазы, в которой витамин Вг в виде тиаминпирофосфата связан со специфическим белком.

В настоящее время совершенно очевидно, что было бы слиш­ ком большим упрощением рассматривать фермент лишь как ис­ точник аминной или какой-либо другой химической группировки. Известно, что для действия фермента нужна не одна активная группа, а целый набор специфических групп, расположенных строго определенным образом в молекуле фермента.

На основании ряда соображений для объяснения действия не­ которых ферментов была выдвинута теория деформации субстра­ та или теория «дыбы». Эта теория хорошо объясняет механизм действия многих ферментов, в первую очередь гидролаз, лиаз, многих трансфераз.

Пусть мы имеем соединение А — В. Рассмотрим явления, ко­ торые происходят при гидролизе этого соединения. Две части этой молекулы — А и В соединены между собой связью, которую мы изобразим на схеме 25 в виде волнистой линии. Представим себе теперь поверхность молекулы фермента как бы имеющую особые

1Ü8