книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

детельствуют следующие данные, характеризующие действие глюкозооксидазы из Penicillium на различные субстраты:

Из этих данных следует, что, хотя фермент обладает очень высокой специфичностью, он все же действует не па один субстрат. Так, глюкозооксидаза довольно энергично окисляет 2-дезокси- D-глюкозу. Мы видим, что a-D-глюкоза окисляется данным фер­ ментом чрезвычайно медленно, хотя она отличается от ß-D-глюко- зы только положением групп Н и ОН у первого углеродного атома по отношению к плоскости кольца. Интересно, что восстанавли­ вающий дисахарид мальтоза, содержащая свободный глюкозидный гидроксил, окисляется глюкозооксидазой лишь с ничтожной скоростью. Таким образом, хотя глюкозооксидаза обладает до­ вольно высокой специфичностью, все же эта специфичность не абсолютна.

Если рассмотреть действие упоминавшейся уже нами ранее пируватдекарбоксилазы, катализирующей декарбоксилирование пировииоградной кислоты с образованием С02 и уксусного аль­ дегида, то можно убедиться в том, что этот фермент декарбоксилирует ие только пируват, но и другие а-кетоксилоты с более длинной углеродной цепочкой — а-кетомасляную, а-кетовалериа- новую и а-кетокапроновую. Однако по мере удлинения углерод­ ной цепочки скорость декарбоксилирования убывает, что ясно видно на рис. 49, а.

Рис. 49. Влияние длины углеродной цепи на декарбоксилирование а-кето- кислот под действием пируватдекарбоксилазы дрожжей (а) и окисление

D-аминокислот оксидазой плесневого гриба Ncurospora (б) (по М. Диксону и Э. Уэббу)

149

Следовательно, хотя фермент действует па одну и ту же груп­

49, 6).

Таким образом, па примере уреазы, глюкозооксидазы, пируватдекарбоксилазы и оксидазы D-амішокпслот мы убеждаемся в том, что фермент, действуя па одну и ту же группировку в моле­ куле различных соединений, небезразличен к составу и строению молекулы субстрата в целом.

Очень важным видом специфичности является стереохими­ ческая специфичность ферментов, т. е. действие фермента на оп­ ределенный оптический изомер одного и того же вещества.

Как известно из органической химии, Г) и L-формы различ­ ных соединений отличаются друг от друга расположением в пространстве группировок, находящихся у так называемого асим­ метрического атома углерода — атома углерода, у которого все четыре валентности заняты различными группировками.

D- и L-соедштения различаются между собой как кисти пра­ вой и левой руки, как предмет и его зеркальное изображение и никак не могут быть совмещены в пространстве. Это ясно видно на рис. 50, на котором изображены молекулярные модели D- и L-алапипа и D- и L-тирозииа.

Еще Луи Пастер в своих классических исследованиях пока­ зал, что D- и L-формы разных органических соединений, в частности винной кислоты, различаются по форме кристаллов, а также и по тому, какиа пих действуют микроорганизмы. Он выра­ щивал плесневый гриб РешсШіит на растворах D- или L-вишюй кислоты, Оказалось, что L-ршшая кислота прекрасно усваивается

150

плесневым грибом, а D-випиая кислота ле усваивается. На осно­ вании этих опытов Пастер сделал вывод, что. живая клетка из­ бирательно относится к D- и L-формам различных органических соединений и сама протоплазма обладает асимметрией. Живая протоплазма прежде всего тем и отличается от мертвой, что она избирательно извлекает из среды: L-стереоизомеры различных органических соединений, оставляя D-изомеры нетронутыми.

Известно также, что стереоизомеры отличаются друг от друга по своему физиологическому действию на организм. Так, напри­ мер, L-аспарагин безвкусен, а его неприродный стереоизомер D- аспарагии обладает сладким вкусом.

В настоящее время целый ряд ферментов изучен в отношении их действия па стереоизомеры соответствующих субстратов. На­ пример, рассмотренный нами ранее фермент глготаматдегидрогеиаза, который катализирует дезаминирование глютаминовой кислоты, действует только на L-глютаминовую кислоту и не дей­ ствует на D-глютаминовую кислоту. Таким образом, глютаматдегидрогеназа обладает абсолютной стереоспецифичностыо по отношению к L-глютаминовой кислоте.

При гидролитическом расщеплении аспарагина образуются

Как видно из уравнения, при этом происходит гидролитичес­ кое отщепление амидной группы. Реакция катализируется фер­ ментом аспарагиназой. Аспарагииаза действует только на при­ родный изомер аспарагина — L-аспарагин и пе действует на D- аепарагин. Если к раствору L-аспарагииа и аспарагиназы доба­ вить D-аспарагш-і, то этот последний будет конкурентно подавлять действие аспарагиназы на L-аспарагии. Это наблюдение свиде­ тельствует о том, что D-аспарагин, хотя и связывается с аспарагииазой по принципу конкурентного торможения, однако не гидро­ лизуется ею. Такое явление, когда D-изомер пе расщепляется ферментом, но конкурентно подавляет действие этого фермента на L-изомер, известно для ряда ферментов.

Прекрасным примером стереоспецифичности действия фермен­ тов является различное их действие на такие изомеры, как а- и ß-формы глюкозы.

151

Выше (см. стр. 149) уже были приведены данные, свидетель­ ствующие о резко различном действии глюкозооксидазы па а- н ß-D-глюкозу.

Эти соединения отличаются друг от друга только взаимным расположением Н и ОН групп по отношению к плоскости кольца у первого углеродного атома. В природе широко распространены производные а- и ß-глюкозы, у которых водород глгокозидпого гидроксила замещен каким-нибудь радикалом. Если таким ради­ калом; является метилыіая группа — СН3, то мы имеем а- метилглюкозид или ß-метилглюкозид. Формулы этих соединений таковы:

Как видно из этих формул, метилглюкозиды представляют собой простые эфиры, которые могут образоваться в результате взаи­ модействия глюкозпдного гидроксила моносахарида с гидроксилом спирта. Эти два вещества, как и другие а- и ß-глюкозиды, раз­ личаются тем, что на одни из них действует фермент а-глюкози- даза, а па другие — ß-глюкозидаза. Эти ферменты строго специ­ фичны: ß-глюкозидаза не расщепляет сс-глгокозиды. Таким образом, а- и ß-глюкозидазы обладают абсолютной специфичностью по от­ ношению к а- или ß-глюкозидной связи. Важно, однако, отме­ тить, что скорость расщепления того или иного глюкозида очень сильно зависит от окружения, которое имеется рядом с а- или ß- глюкозидной связью. Так, при гидролизе ß-D-метилгліокозида под действием ß-глюкозидазы образуется ß-D-глюкоза и мети­ ловый спирт:

Природа несахарного компонента глюкозида (аглюкона) су­ щественно влияет на действие ß-глюкозидазы: скорость расщеп­ ления глюкозидиой связи очень сильно зависит от природы аглю­ кона.

152

Влияние природы аглюкона иа скорость гидролиза различ­ ных глюкозидов ß-гліокозидазой может быть продемонстрировано следующими данными:

ОСЫз

Таким образом, мы видим, что скорость расщепления глюкозида, аглгокоиом которого является ванилин, почти в 400 раз выше, чем скорость расщепления ß-метилглюкозида. Следова­ тельно, в данном случае более сложная структура аглюкона — ванилина способствует ускорению расщепления ß-глюкозидиой связи.

Этот пример наглядно показывает, что для действия фермента важна не только структура той группировки в молекуле субстра­ та, па которую он действует, не только ее стереохимическая кон­ фигурация, но и «окружение», имеющееся рядом с расщепляе­ мой связью.

Рассмотрим теперь значение цис- и траке-изомерии для дей­ ствия ферментов. Этот вид изомерии, т. е. расположение радика­ лов по отношению к двойной связи между двумя атомами углеро­ да, также оказывает большое влияние на действие фермента. Мы можем рассмотреть подобное влияние на примере фермента L- аспартат — аммиак-лиазы (аспартазы). Она катализирует иегидролитическое отщепление аммиака от аспарагиновой кислоты с образованием фумаровой кислоты:

СООН—СІ-І2-С Н -С О О Н ^ С О О Н -С Н = С Н -С О О Н + Ш з .

Nl-b

Формула фумаровой кислоты такова:

СООН

I

нс=сн ноосI

Следовательно, она представляет собой транс-изомер, так как в ее молекуле карбоксильные группы расположены по разные стороны от двойной связи. Ifuc-пзомером является малеиновая кислота, у которой оба карбоксила расположены рядом, по одну сторону от двойной связи, что приводит к значительным разли­

153

чиям в химических свойствах этих двух соединений. Формула малеиновой кислоты такова:

С Н = С Н

I I

HOOG СООН

Малеиновая кислота ие встречается в природе, по является очень важным исходным продуктом для целого ряда синтезов в органической химии. Выяснилось, что аспартаза действует толь­ ко на фумаровуго кислоту, совершенно не реагируя с малеиновой кислотой. Производные малеиновой кислоты сильно угнетают раз­ личные процессы в растительных тканях. Поэтому некоторые про­ изводные малеиновой кислоты, например гидразид малеиновой кислоты, находят широкое применение в народном хозяйстве. Даже незначительного количества этого соединения достаточно для того, чтобы полностью подавить дыхание и прорастание ово­ щей и корней сахарной свеклы при храпении.

Наконец, известны случаи особенно топкой стереоспецифич­ ности ферментов, когда в совершенно симметричной молекуле субстрата фермент различает одинаковые группы, которые хи­ мик не может различить с помощью имеющихся в его распоряже­ нии средств. Так, например, если мы имеем соединение Cx'xyz, то X, х ', у и z означают четыре различные группы, связанные с уг­ леродным атомом. При этом, хотя две группы х и х' химически совершенно одинаковы, фермент действует лишь на одну из них, в результате чего образуется лишь один оптический изомер ве­ щества Cx'xyz. Пример подобного рода стереоспецифичности фермента мы имеем в случае фосфорилирования глицерина под действием глицеролкиназы — образуется лишь L-глицеро-З-фос- фат. Тот факт, что к симметричной молекуле глицерина остаток фосфорной кислоты присоединяется только лишь в третьем по­ ложении, был подтвержден опытами, в которых был взят глице­ рин, меченный радиоактивным углеродом С14 в положении 1. При этом реакция шла следующим образом (углерод С14 отмечен звездочкой):

Такого рода стереоспецифичиость фермента может быть на­ глядно показана в виде схемы 23. На этой схеме молекула субст­ рата изображена в виде тетраэдра, по углам которого располо­ жены группы X , х', у и Z . X, Y и Z в кружках представляют со­ бой специфические группировки в молекуле фермента, по месту которых к нему присоединяется субстрат. X в кружке с черточ­ ками является той группой фермента, которая активирует груп­

154

пировку х в молекуле субстрата. Из схемы 23 совершенію оче­ видно, что, поскольку каждая группа субстрата должна связать­ ся с определенной группировкой в молекуле фермента — х с X, у с Y, z с Z, при любом расположении субстрата по отношению к ферменту с активирующей группировкой может связаться только лишь определенная группа, а имепно х '.

Схема 23. СтерсоспецііфпчIIость фермента по отноше­ нию к субстрату Cx'xyz

(по А. Огстолу)

Весьма детально разработан вопрос о специфичности протео­ литических ферментов (протеаз), катализирующих гидролиз бел­ ков и пептидов. Первоначально проблему специфичности дейст­ вия протеаз связывали с размером молекулы субстрата, на кото­

ферментов на синтетические пептиды, были получены первые данные, говорящие о том, что не все пептидные связи атакуются с одинаковой скоростью ферментами. Проблема специфичности действия протеолитических ферментов была разрешена главным образом благодаря работам М. Бергмапна, Д. Фрутона и их сот­ рудников. На основании огромного количества экспериментальных данных, полученных с различными синтетическими субстратами, было установлено, что каждый протеолитический фермент предъ­

зует пептидные связи с участием аминной группы тирозина или фенилаланина. Типичным специфическим синтетическим субстра­ том для пепсина может служить карбобеизокси-Ь-глготамил-Ь- тирозин:

оо

Пепсин

155

зует не только пептидные, но и некоторые эфирные и амидные связи.

В качестве примера рассмотрим расщепление трипсином не­ которых производных бензоил-Ь-аргинина.

H ä N — C = N H

NH

(С Н а ) з

I

C J - H — С О — N H - C H — С О О П

Веікюил-Б-арглшпі

Если в карбоксильную группу бензоил-Ь-аргинина ввести амид­ ную группу — NH2. то мы получим беизоил-Ё-аргининамид. Ока­ залось, что трипсин расщепляет амидную связь в этом соедине­ нии даже с большей скоростью, чем пептидные связи. Если взять метиловый или этиловый эфир бензоил-Ь-аргинина, то трипсин с исключительной скоростью расщепляет имеющиеся в них эфир­ ные связи, образуя соответственно метиловый или этиловый спирт и беизоил-Ь-аргинпп.

N Н >

C = N H

N11

I

(СНі )з О

I ./

С И — С — О С г Ш

I Г

N H Трипсин

'|со

С 6Н 5

Этиловый эфир бензонл-Ь-аргшшна

Химотринсин энергично гидролизует этиловый эфир ацетил- L-тирозина. Таким образом, трипсин и химотринсин обладают очень высокой эстеразной активностью. Эстеразной активностью обладают также и другие протеолитические ферменты.

Эстеразная активность нашла широкое применение в лабо­ раторной практике при определении активности препаратов про­ теолитических ферментов. Это объясняется простотой определе­ ния эстеразной активности путем прямого титрования щелочью.

Следовательно, мы убедились в том, что трипсин имеет трой­ ную специфичность — он катализирует расщепление трех раз­ личных типов химических связей: 1) пептидных, в образовании которых участвуют карбоксильные группы аргинина или лизина, 2) амидных и 3) наиболее энергично он расщепляет сложноэфир­ ные связи, образуемые'карбоксилом аминокислоты и спиртом.

158