книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

Если насыщающей является концентрация [А1, то соответст­ венно

‘ab к.

ЕА -I- В ;=-^ ЕАВ —> Е -I- Г,

"ab

[В] - !

Кь

В качестве примера ферментативной реакции, в которой уча­ ствуют два субстрата, рассмотрим катализируемую алкргольдегидрогеназой реакцию переноса водорода от этанола к НАД+.

Эта реакция может быть представлена как состоящая из сле­ дующих этапов:

'■а

Е + 11АД+ ^ Е—ИАД+

ка

Е-Н АД -И ^ И А Д - Н + Е

Таким образом, фермент обладает сродством ко всем четырем компонентам реакции. Для алкогольдегидрогеназы дрожжей эксперимент дает следующие величины константы Михаэлиса (в молях!л):

И н г и б и р о в а н и е и з б ы т к о м с у б с т р а т а и л и п р о д у к т а р е а к ц и и . При большом избытке субстрата кривые зависимости скорости реакции от концентрации субстрата имеют вид, представленный на рис. 39.

Механизм ингибирующего действия избытка субстрата может быть весьма разнообразным. На рис. 40 схематически представ­ лены различные случаи субстратного ингибирования.

Рнс. 39. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при его тормозящем действии

Если имеет место субстратное ингибирование по типу а, т. е. когда молекула субстрата соединяется с двумя (пли более) функцио­ нальными группами фермента, то возможно, что при очень высокой концентрации субстрата к этим группам присоединяются сразу

Рис. 40. Схематическое изо­ бражение возможных меха­ низмов субстратного инги­ бирования (по Д. Уэббу)

Слева — схемы нормального по­ ложения, когда образуется обычный фсрмсит-субстратныГі комплекс, обеспечивающий те­ чение реакции; справа — поло­ жения, при которых происхо­ дит субстратное ингибирование (а — Q— различные типы суб­ стратного ингибирования; 1 и 2 — различные функциональные группы субстрата, взаимодейст­ вующие с ферментом; Л — ак­ цептор; Д — донор)

т

две (или более) молекулы субстрата, как показано в правой части рисунка. В результате образуется неактивный фермент-субстрат- ный комплекс в соответствии с уравнением

Е + 2 S ^ ESä.

Если реакция идет по типу б, то для того чтобы она прошла, субстрат должен присоединиться к фермеіпу лишь в одном ме­ сте (слева); однако субстрат может присоединиться и к другой функциональной группе фермента (справа), и образующийся при этом фермеит-субстратиый комплекс будет неактивен. В случае в для действия фермента необходим активатор (на рисунке зату­ шеван), но при большом избытке субстрата этот последний связы­ вает активатор и фермент инактивируется. Следующий тип суб­ стратного ингибирования представлеи схемой г. В данном случае настоящим субстратом является соединение субстрата и активатора (слева); при значительном избытке субстрата этот последний, связываясь с ферментом (справа), может подменять истинный суб­ страт. Тип субстратного ингибирования, обозначенный буквой д, касается реакций переноса различных групп с одного субстрата на другой (слева — с донора Д на акцептор А) \ избыток субстрата препятствует нормальному течению реакции, поскольку один донор может препятствовать нормальному соединению акцептора с ферментом.

Ингибирование ферментативной реакции продуктами реакции может происходить двояким образом. Поскольку большинство ферментативных реакций обратимо, накопление продуктов реак­ ции вызывает сдвиг равновесия в обратную сторону, и вследствие этого прямая реакция замедляется. Однако в данном случае нужно иметь в виду, что в большинстве ферментативных реакций равновесие сдвинуто в какую-то одну сторону и обратная реакция протекает медленно. Другой тип ингибирования продуктом реак­ ции заключается в том, что продукт реакции может связываться с ферментом или другим компонентом ферментной системы (акти­ ватором, коэнзимом) и, инактивируя фермент, таким образом снижать скорость реакции. Прекрасным примером подобного дей­ ствия продукта реакции является ингибирование гексокиназы. Как известно, гексокиназа катализирует следующую реакцию.

D-Гексоза + АТФ ^ Б-гексозо-б-фосфат -|- АДФ.

Гексокиназа мозга очень сильно подавляется продуктом этой реакции — глюкозо-6-фосфатом. Однако тут же нужно отметить, что на дрожжевую гексокиназу глюкозо-6-фосфат не действует. Таким образом, в данном случае мы имеем пример того, что один и тот же фермент, но полученный из различных организмов, мо­ жет сильно различаться по своим свойствам, что, вероятно, свя­ зано с особенностями его первичной, вторичной и третичной структур.

5* 131

В л и я н и е т е м п е р а т у р ы . Скорость ферментативной реакции, помимо концентрации субстрата, зависит от ряда других факторов, в первую очередь от температуры, при которой проте­ кает реакция. Общий вид кривой, характеризующей влияние температуры на активность фермента, можно изобразить в виде графика, представленного на рис. 41.

находится при 50°. Эта температура называется о п т и м а л ь ­ н о й т е м п е р а т у р о й для действия данного фермента.

Подобная кривая характерна для всех ферментов, только оптимумы могут быть различными. Так, например, если мы имеем дело с ферментом а-амилазой из проросшего зерна, расщепляющей крахмал с образованием декстринов и мальтозы, то оптимальной является температура 60°. В случае а-амилазы плесневого гриба Aspergillus oryzae (так называемого японского гриба), который широко применяется в промышленности для получения препаратов этого фермента, оптимальная температура сдвигается несколько ниже — к 50—55°. Таким образом, а-амилаза гриба Aspergillus oryzae более чувствительна к температуре, чем а-амплаза из про­ росшего зерна. Влияние температуры на скорость ферментатив­ ной реакции, описываемое кривой, изображенной на рис. 41, может объясняться целым рядом причин. Прежде всего здесь нуж­ но назвать влияние температуры па сам фермент, па скорость его денатурации. Далее это влияние температуры на скорость расщеп­ ления комплекса ES па свободный фермент и продукт реакции, т. е. на константу скорости реакции к+2 (см. стр. 121). Немало­ важное значение имеет влияние температуры на сродство фермеи-

Рне. 41. Влияние температуры на активность глютаматдегидрогеназы пшеничных зародышей (по В. Л. Кретовичу)

Рис. 42. Энергетическая схема ферментативной реакции

132

которое для обеих реакций одинаково. Реакция, которая идет слева направо,— реакция экзотермическая, потому что она со­ провождается выделением энергии; наоборот, обратная реакция— эндотермическая, поскольку для ее протекания требуется опреде­ ленное количество энергии. Необходимо подчеркнуть, что энер­ гия выделяется или поглощается не обязательно в виде тепла. Поэтому мы говорим, что реакция, происходящая с поглощением энергии,— это э и д о р г о т і п ч е с к а я р е а к ц и я, а реак­ ция, идущая с выделением какого-то количества энергии, назы­ вается э к з э р г о н и ч е с к о й реакцией. Величину энергии активации обычно выражают в калориях на моль субстрата.

Сущность действия фермента заключается в том, что он, на­ правляя реакцию, так сказать, обходным путем, снижает энер­ гию активации, необходимую для протекания данной реакции. Поэтому если приведенная реакция протекает так, как это схе­ матически показано на рис. 42, то с катализатором она будет протекать иначе (пунктирная кривая).

Пусть у нас имеется реакция AB — А В.

Если присутствует фермент Е, то будут происходить следую­ щие реакции: AB Е —>~ABE; АВЕ BE -f А и BE — Е -г В.

Таким образом, мы имеем тот же конечный результат — обра­ зование веществ А и В, но, кроме того, освобождается фермент, который принимал участие в реакции и вышел из нее неизме­ ненным.

Эти промежуточные реакции могут идти при горазди меньшей энергии активации, чем исходная суммарная реакция. Следова­ тельно, фермент снижает энергию активации данной химической реакции.

Приведем некоторые примеры снижения энергии активации под действием фермента. Возьмем реакцию гидролиза сахарозы на глюкозу и фруктозу. Без катализатора энергия активации этой реакции составляет 32 тыс. малых калорий на 1 грамммолекулу: с ионами водорода в качестве катализатора она со­ ставляет 25 тыс. малых калорий на 1 грамм-молекулу, а с фермен­ том ß-фруктофураиозидазой (сахаразой) — 9400 малых калорий на грамм-молекулу.

Таким образом, в присутствии ß-фруктофуранозидазы энергия активации почти в четыре раза меньше энергии активации этой же реакции, протекающей без фермента.

Рассмотрим реакцию разложения перекиси водорода на воду и кислород: 2Н20 2 = 2Н20 + 0 2.

Без катализатора энергия активации этой реакции составляет 18 тыс. малых калорий на 1 грамм-молекулу, с катализатором кол­ лоидной платиной — 11 700 малых калорий на грамм-молекулу, а с ферментом каталазой — 1700—1300 малых калорий на грамммолекулу.

Из цифр совершенно очевидно, что катализатор снижает энер­ гию активации и, кроме того, что фермент снижает энергию акти­

134

вации значительно сильнее, чем неорганический катализатор. Это указывает па высокую эффективность действия ферментов.

Влияние температуры на скорость химической реакции может быть охарактеризовано эмпирическим уравнением Аррениуса. Оно имеет следующий вид:

Т— абсолютная температура в шкале Кельвина;

Е— энергия активации данной реакции.

Для того чтобы охарактеризовать влияние температуры на

Это выражение дает возможность определить энергию акти­ вации путем определения значения Qi0 для данной ферментатив­ ной реакции.

Надо сказать, что ()10 — температурный коэффициент реак­ ции — в случае ферментативных реакций равен 1—2, в то время как для химических реакций, идущих без фермента, Ql0 обычно равен 2—3 (коэффициент Вант-Гоффа).

Мы уже указали выше, что резкое снижение скорости фермен­ тативной реакции при высоких температурах, превышающих оптимальную, зависит в первую очередь от разрушения фермент­ ного белка, от его денатурации. Поэтому очень важным показа­ телем, характеризующим отношение фермента к температуре, является его термолабильность, т. е. скорость инактивации са­ мого фермента под влиянием температуры. Обычно для опреде­ ления термолабильности фермента берут его раствор и наполняют им серию пробирок. Эти пробирки помещают в термостат при раз­ ных температурах, например при температуре 20, 30, 40, 50° ит. д.,и выдерживают их там в течение определенного времени. В эти пробирки субстрат не добавляют. По окончании инку­ бации содержимое всех пробирок охлаждают, добавляют в них субстрат и затем проводят реакцию при одной и той же темпера­ туре, например при 50° (выбирают температуру,' оптимальную для действия данного фермента). Таким образом сравнивают ак­ тивность фермента, предварительно прогретого при разных тем­ пературах. При этом очень важно, чтобы кривые, характеризую­ щие влияние температуры на фермепт, т. е. его термолабильность,

135

7ро0олжительнасть прогревания, мин.

Рис. 43. Влияние прогревания пепсина при равных значениях pH па ого инактивацию и денатурацию белка (по Д. Нортропу)

1 — азот; 2 — активность

Рис. 44. Изменение активности а-амплазы из Aspergillus onjzae в резуль­

тате ее прогревания при 60° п pH 5,6 (по Томпта и Киму)

1 — прогревалась одна а-амнлаза; 2 — а-амилаза прогревалась в присутствии 0,6% крахмала

были получены при строго определенных условиях: определенном значении pH и определенном солевом составе среды. Дело в том, что один и тот же фермент при одном pH может быть более термо­ стабилен, чем при другом. Так, например, пепсин хорошо выдер­ живает прогревание в кислой среде и быстро инактивируется при нагревании в щелочной среде. Это ясно видно па рис. 43. Из этого рисунка видно также, что тепловая инактивация фермента явля­ ется результатом денатурации белка: между этими двумя процес­ сами имеется строгая пропорциональность.

Большое влияние на термолабильпость фермента оказілвает присутствие субстрата. Многие ферменты, например оксидаза аминокислот, глютаматдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, бак­ териальная и грибная а-амилазы, могут быть защищены от дена­ турации и инактивации соответствующими коферментами или суб­ стратами. На рис. 44 в качестве примера подобного защитного действия показано влияние крахмала на тепловую инактивацию сс-амилазы из Aspergillus orуте.

Защитное действие субстрата, по-видимому, объясняется тем, что, связываясь с ферментом и образуя соединение фермент — суб­ страт, он стабилизирует его вторичную и третичную структуру, делая ее более устойчивой ко всяким неблагоприятным, в том числе температурным, воздействиям, что иллюстрируется схемой 21. В верхней части этой схемы показано, что полипептидная цепочка фермента, содержащая какие-то две группировки (за­ штрихованные прямоугольники), к которым присоединяется суб­ страт, под влиянием нагревания теряет свойственную ей нативную структуру, развертывается и денатурируется. Если же фермент

166

Схема 21. Стабилизирующее плияшіо субстрата на полнпептпдиую цепь фермента при денатурации (S — субстрат)

соединен с субстратом (обозначен буквой S), то этот последний как бы стягивает, закрепляет вторичную (а также, конечно, и третичную) структуру полипептидной цепочки, препятствуя та­ ким образом ее развертыванию и денатурации.

Очень высокой термостабилыюстыо обладают ферменты тер­ мофильных микроорганизмов, способных жить и развиваться при повышенных температурах. Так, например, кристаллическая а-амилаза термофильной спороносной бактерии Bacillus stearothermophilus не теряет своей активности после нагревания в те­ чение 24 час. при 70°. Весьма легко денатурируются и инактиви­ руются под влиянием нагревания различные дегидрогеназы.Поэ­ тому особенно разительно различие в термостабильности глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (см. стр. 197) из мышц кролика и из Bacillus stearolhermophilus. При нагревании кристаллических препаратов этого фермента в дистиллированной воде в течение 10 мин. Р. Амелунксеном были получены следующие величины, характеризующие термостабильность фермента:

Из приведенных данных видно, что, хотя фермент и в мышцах кролика и в клетках бактерии выполняет одну и ту же катали­ тическую функцию, его молекулярная структура и связанные с лей физико-химические свойства весьма различны. Выяснение особенностей сложившейся в процессе эволюции молекулярной структуры ферментов термофильных микробов является чрезвы­ чайно интересной и важной задачей.

137

В л и я п и е pH. Следующий фактор, который очейь сильно влияет на активность фермента,— рП или активная кислотность среды (концентрация водородных ионов). Это впервые было по­ казано в начале XX в. известным датским биохимиком С. П. Л.

матдекарбоксилазы, а-амилазы слюны и аргиназы мы получим зависимость, изображенную па рис. 45.

Из рисунка видно, что пепсин — протеаза, содержащаяся в желудочном соке человека и животных, имеет оптимум действия при pH 2,0. Оптимум действия глютаматдекарбоксилазы находит­ ся при pH около 6, а слюнной а-амилазы — вблизи нейтраль­ ной реакции; аргиназа — фермент, гидролизующий аргинии с образованием мочевины и орнитина (см. стр. 169), имеет оптимум действия при сильнощелочной реакции.

Ход кривой, показывающей влияние pH па действие фермента, зависит от целого ряда факторов.

1.Поскольку фермент является белком и содержит различ­ ные иопизирующие группы, изменение pH среды изменяет со­ стояние ионизации этих групп, а следовательно, и заряд белковых молекул. Взаимодействие субстрата с ферментом зависит от рас­ пределения зарядов в молекуле этого последнего.

2.Если субстрат имеет заряды, то сродство его разных ион­ ных форм к ферменту различно.

3.Превращение комплекса фермент — субстрат и комплекса фермент — продукт может происходить лишь при каком-то опре­ деленном состоянии ионизации комплекса.

4.В некоторых ферментативных реакциях водородные или гидроксильные ионы могут непосредственно участвовать в реак­ ции. Это, в частности, наблюдается при окислительно-восстано­ вительных реакциях.

5.Мы уже указывали выше, что скорость денатурации и инак­ тивации фермента зависит от pH. Следовательно, pH оказывает влияние на стабильность фермента.

Таким образом, очевидно, что кривая, характеризующая влияние pH на активность фермента, является суммарной, от­ ражающей весьма сложный характер влияния pH ,на целый ряд факторов, от которых зависит скорость данной ферментативной реакции.

При определении pH, оптимального для действия данного фермента, очень важным является состав среды, в которой идет

реакция, например состав используемой буферной смеси. Кри­ вые, характеризующие влияние pH, могут значительно различать­ ся при использовании разных буферных смесей.

Оптимум pH для действия фермента зависит также от кон­ центрации тех или иных ионов в реакционной среде. Например, для щелочной фруктозодифосфатазы из листьев шпината, ката-

138