книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

Кривая, изображенная на рис. 32, показывает, что в первый промежуток времени, когда глубина превращения мала, реакция является реакцией нулевого порядка, а затем скорость реакции начинает снижаться и в конце концов кинетическая кривая при­ ближается к линии, параллельной оси абсцисс.

Здесь нужно подчеркнуть, что при определении кинетических данных, касающихся того или иного фермента, очень важно полу­ чить эти данные в первый момент протекания реакции, когда со­ храняется прямо пропорциональная зависимость между нараста­ нием продукта и временем инкубации, т. е. реакция является ре­ акцией нулевого порядка.

Ферментативные реакции второго порядка характеризуются тем, что их скорость пропорциональна произведению концентра­ ций реагирующих веществ:

V = к [А]• [В].

К числу реакций второго порядка относятся всё реакции пере­ носа групп, например рассматривавшиеся нами ранее реакции переаминироваиия, а также окислительно-восстановительные ре­ акции. Примером реакции второго порядка является также уже рассматривавшаяся нами ранее реакция гидролиза сахарозы под действием фермента ß-фруктофуранозидазы:

сы-ьоп + і-ьо ^ са-ь-Ои + сл-ьоо.

Сахароза Глюкоза Фруктоза

Однако, хотя эта реакция является реакцией второго порядка, фактически она протекает в соответствии с законом реакции пер­ вого порядка, поскольку концентрация воды настолько велика, что практически представляет собой постоянную величину, не изменяющуюся за время протекания реакции. К числу подобных реакций, фактически протекающих по закону реакций первого порядка, относятся реакции гидролиза и гидратации.

Все ферментативные реакции в самом начале своего протека­ ния (т. е. когда присутствует значительный избыток субстрата и образовалось мало продуктов реакции) являются реакциями нулевого порядка, и только потом они приобретают характер реак­ ций первого или второго порядка. Именно поэтому для опреде­ ления удельной активности того или иного ферментного препа­ рата используют данные, полученные в начальный период реак­ ции — за первые несколько секунд или минут.

В л и я н и е ^ к о н ц е н т р а ц и и ф е р м е н т а и с у б ­ с т р а т а н а с к о р о с т ь ф е р м е н т а т и в н о й р е а к ­ ц и и .

При условии избытка субстрата скорость ферментативной ре­ акции зависит прежде всего от концентрации фермента. Таким образом, мы можем написать, что ѵ = /с-[Е], где [Е] — концен­ трация фермента.

119

Если константа диссоциации комплекса фермент—субстрат К велика, то велико значение к_г и мало значение А+1. Отсюда сле­ дует, что комплекс очень легко распадается на исходные вещества и реакция идет медленно. Наоборот, если константа к.п велика и /с-! мала, то К$ будет мала и ферментативная реакция будет идти быстро.

Исходя из закона действующих масс, мы можем написать сле­ дующее уравнение:

[S] -([Ео]—[ES])=А-Ѵ [ES],

где [E01 — это общая концентрация фермента в начале данной ферментативной реакции, а [ES] — концентрация соединения фер­ мент—субстрат.

Выражение [Е0] — [ES] представляет собой концентрацию сво­ бодного фермента за вычетом концентрации фермента, связанного с субстратом.

Далее мы можем преобразовать данное уравнение:

[S]

[ES]=[Eü] x7+[sT-

Следовательно, чем больше выражение [ES], тем больше скорость данной ферментативной реакции. Максимальная скорость данной ферментативной реакции достигается тогда, когда концентрация со­ единения фермент—субстрат равна общей концентрации фермента, т. е. [ES] = [Е0]. Следовательно, скорость будет максимальной при условии, что весь фермент войдет в соединение с субстратом и будет им полностью насыщен.

Таким образом, можно написать следующую зависимость:

V _ [ES]

vmax [Ео]

т. е. скорость данной реакции так относится к максимальной ско­ рости реакции, как [ES] относится к [Е0].

Но мы знаем, что

Обычно ѵтах обозначают буквой V. Тогда это последнее выражение будет иметь такой вид:

[S]

ѵ = Ѵ К, + IS} ■

щ

Это последнее уравнение названо у р а в н е н и е м М и х а-

к концентрации субстрата практически не изменит ее значение. Если концентрация субстрата [S] мала, то добавление ее к кон­ станте диссоциации K s почти не изменит ее, и мы можем написать

следующее уравнение:

Но это уже типичная реакция первого порядка, т. е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата в каждый данный момент.

Михаэлис и Ментен изобразили графически зависимость между концентрацией субстрата и скоростью реакции на примере рас­ щепления сахарозы на глюкозу и фруктозу под действием ß-фрук- тофуранозидазы (рис. 35).

По оси абсцисс отложена концентрация субстрата, а по оси ординат величина ѵ, т. е. скорость реакции расщепления са­ харозы. Из рисунка видно, что при низких концентрациях суб­ страта мы имеем дело с реакцией первого порядка, а при очень высоких его концентрациях — с реакцией нулевого порядка, когда скорость реакции становится постоянной величиной, равной максимальной скорости реакции.

Для большего удобства уравнение Михаэлиса — Ментен было преобразовано Лайнупвером и Берком по методу двойных обрат­ ных величин, т. е. на основании того принципа, что если имеется равенство между двумя какими-либо величинами, то и обратные величины тоже будут равны.

В таком случае уравнение Михаэлиса — Ментен будет выгля­ деть следующим образом:

К, [S]

Иначе его можно написать в таком виде:

Таким образом, это последнее уравнение является уравне­ нием Михаэлиса — Ментен, преобразованным но методу двойных обратных величин, т. е. уравнением Лайнуивера — Берка.

Если бы мы захотели графически изобразить уравнение Лай­ нуивера — Берка, то это выглядело бы так, как представлено на рис. 36.

123

Уравнение Холдейна — Бриггса таково:

[S]

Здесь К т представляет собой так называемую константу Михаэлиса.

Константа Михаэлиса имеет очень большое значение в энзимологни и является важной характеристикой данного фермента. В классическом уравнении Михаэлиса — Ментен фигурирует Ks, т. е. константа диссоциации соединения фермент—субстрат.

Константа Михаэлиса К т может быть выражена следующим образом:

Мы видим, что в числителе находятся константы скоростей реакций расщепления комплекса фермент—субстрат как в направ­ лении расщепления на фермент и субстрат, так и в направлении расщепления на фермент и конечный продукт реакции.

Поскольку

м о л я х н а л и т р ) , п р и к о т о р о й н а б л ю д а е т с я

вии НАД+ реакцию окисления этилового спирта с образованием уксусного альдегида, Ks = ІО“7 моля/л, а К т = ІО-5 моля/л.

При выделении нового фермента очень важно знать константу Михаэлиса. К т нужно определять по возможности с наиболее чистыми ферментными препаратами. Вместе с тем ее следует опре­ делять при строго постоянных условиях (і°, pH и т. д.) и по воз­ можности за самый короткий начальный период реакции.

Графически константа Михаэлиса может быть представлена так, как это показано на рис. 37. По оси абсцисс отложена кон­ центрация субстрата, а по оси ординат — скорость реакции.

125

Если мы отметим на этом графике скорость, равную половине максимальной, то соответствующий отрезок на оси абсцисс будет представлять собой константу Михаэлиса.

Таким образом, пользуясь подобным графиком, можно найти значение К т для того или иного фермента. Для построения гра­ фика мы должны определять скорость реакции ѵ при различных значениях концентрации субстрата; в конце концов при этом мы установим значение максимальной скорости реакции V, когда увеличение концентрации субстрата уже не будет влиять на ско­ рость реакции, и затем найдем К т. Еще раз нужно подчеркнуть,

Рис. 37. Графическое изображение констапты Михаэлиса

Рис. 38. Графический способ нахождения константы Михаэлиса по методу двойных обратных величин Лайпунвера и Берка

что константу Михаэлиса нужно определять за возможно более короткий первоначальный промежуток времени и пользоваться достаточно очищенным ферментным препаратом, так как содер­ жащиеся в нем примеси могут сильно влиять на величину К т.

Уравнение Михаэлиса — Ментен, обработанное по методу двойных обратных величин Лайнуивера — Берка, имеет следую­ щий вид:

Это уравнение аналогично выражению у = ах -(- Ь, т. е. уравне­ нию прямой линии.

Если по оси абсцисс мы отложим -гщ~, а по оси ординат — ,

отсекаемый прямой от оси ординат, это -у- . Если мы продолжим

полученную прямую за ось ординат, то она отсечет от оси абсцисс отрезок, который равен обратной величине константы Михаэ-

1 лиса---- —m.

-126

Графический способ нахождения константы Михаэлиса по ме­ тоду двойных обратных величин широко применяется в настоящее время в энзимологии.

Ф е р м е н т а т и в н ы е р е а к д и и с д в у м я с у б- с т р а т а м и. Во всех предыдущих рассуждениях мы схемати­ зировали течение ферментативной реакции, предполагая, что фер­ мент взаимодействует лишь с одним субстратом. Однако значи­ тельное большинство ферментативных реакций является реакция­

соединения фермент—субстрат в случае бимолекулярной реакции:

еав

I

Мы можем рассмотреть этот процесс, предполагая, что он слагается из следующих четырех реакций:

Поскольку скорость реакции в целом пропорциональна кон­ центрации фермент-субстратного комплекса [ЕАВ], т. е. V = к [ЕАВ], мы, заменяя [ЕАВ], получим

ME]

127

I

Это уравнение содержит только три из четырех констант равно­

Принимая концентрацию одного из субстратов, например [В], постоянной и изменяя концентрацию другого, в данном случае [А], мы получим уравнение

*[В]

л-;+[В] [Е]-[А]

А’ A-(, + Ä [В]

[А]-

А;, + [В ]

Это уравнение дает кривую типа кривой Михаэлиса.

Таким образом, кажущееся сродство фермента к А зависит от

г>= [А] -j- Ка

В первом случае кажущаяся константа Михаэлиса равна К 'а1 а во втором — К а. Точно так же, если постоянной (очень большой или очень малой) будет [А], то изменение ѵ в зависимости от [В]

дает возможность определить Кь и Къ- Если концентрация [В] значительно превосходит концентра­

цию [А] и является насыщающей, то весь фермент присутствует в форме соединения ЕВ, и тогда из уравнения

kba кг

ЕВ + А ^ ЕАВ —> Е + Р

кЬа

мы найдем, что

М ЕНА]

ѵг$