книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

Этот процесс идет в соответствии с уравнением

Таким образом, ферредоксші участвует в реакциях, приводя­ щих к образованию пировиноградной и а-кетоглютаровой кис­ лот,— соединений, играющих важнейшую роль в процессе фикса­ ции молекулярного азота. Новейшие исследования полностью подтвердили правильность идеи С. Н. Виноградского, согласно которой первичным продуктом, образующимся при фиксации молекулярного азота почвенными микроорганизмами, является аммиак.

В процессе образования аммиака из молекулярного азота как раз ферредоксину принадлежит важнейшая роль. Ферментативное превращение молекулярного азота в аммиак требует участия АТФ (как источника энергии) и восстановленного ферредоксина. Пировиноградная кислота (и, вероятно, другие кетокислоты) иг­ рает в данном случае двойную роль. С одной стороны, она является тем материалом, который используется для образования АТФ, а с другой — источником электронов, необходимых для восстанов­ ления ферредоксина. Ферредоксин может быть также восстанов­ лен молекулярным водородом при участии фермента гидрогеназы. Вероятная роль ферредоксина в процессе фиксации молекуляр­ ного азота Clostridium, pasteurianum может быть показана в виде схемы 17.

Схема 17. Участие ферредоксина в процессе фиксации азота у Clostridium pasteurianum (по А. Д ’Эустахио и Р. Гарди)

Рассматривая роль ферредоксина в процессе фиксации молеку" лярного азота, нужно, однако, заметить, что он содержится и у бактерий, неспособных фиксировать азот — у некоторых дру­ гих представителей рода Clostridium и у некоторых микронокков.

Роль ферредоксина в процессе фотосинтеза заключается в том, что ферредоксин подвергается фотовосстановлению, происходя­

109

При замене цинка Со2+ резко повышается пептидазная активность,

ностью исчезает пептидазная. Таким образом, карбоксипепти­ даза А может служить примером того, что металл, содержащийся в ферменте, оказывает большое влияние не только на его актив­ ность, но и на специфичность его действия.

Для многих ферментов необходимым кофактором является магний. В качестве таких Mg2+-3aBiicHMbix ферментов можно на­

Фосфопируват-гидратаза, участвующая в процессах дьтх'аиия,

Рибулозодифосфаткарбоксилаза играет важнейшую роль в процессе фотосинтеза, катализируя реакцию присоединения угле­ кислоты к D-рибулозо-1,5-дифосфату:

СШ -О-РО-Д

Магний является также необходимым кофактором для целого ряда ферментных систем, катализирующих при участии АТФ ре­ акции переноса остатков фосфорной кислоты.

Прочность связи металла с ферментом зависит от природы металла и от того, с какими функциональными группами он свя­ зан. Металлы, входящие в состав ферментов, образуют комплекс­ ные соединения с различными функциональными группами анофермента и коэнзима, содержащими атомы с неподеленньши парами электронов — S, N и О. Так, например, атом железа, вхо­ дящий в состав гема, который представляет собой простетическую группу ферментов пероксидазы и каталазы, а также цито-

национными связями с имидазольнои группой гистидина и е-ами- ногруппой лизина, входящими в состав апофермента.

Атом цинка, содержащийся в составе молекулы карбоксипеп­ тидазы А, соединен координационными связями со свободной

111

аминной группой N-концевого остатка аспарагина и с сульфгидрильными группами апофермента. В молекуле глицеральдегидфосфатдегндрогеназы цинк, по-видимому, связывается с кисло­ родом фосфорной кислоты коэнзима и субстрата, а также с серой сульфгидрилы-юй группы и азотом гистидина в апоферменте. В медьпротеидах, подобных о-дифенолоксидазе и аскорбинатоксидазе, атом меди, видимо, соединен координационными связями с атомами серы и азота в апоферменте. С серой связано также железо, содержащееся в ферредоксинах. Немаловажную роль в связывании металлов играют, по-видимому, также карбоксиль­ ные группы ферментов.

Каков механизм участия металла в действии фермента? Во-первых, металл может способствовать образованию проме­

жуточного соединения между ферментом и субстратом. Именно такой случай наблюдается при действии помещенной нами в табл. 1 лейцинаминопептпдазы и карбоксипептидазы А — присоедине­ ние фермента к субстрату осуществляется благодаря образова­ нию координационных связей через атом марганца (или магния) и атом цинка (схема 19).

Схема 19. Роль металла в присоединении субстрата к ферменту

Во-вторых, металл может сам участвовать в реакции, например в переносе электронов, т. е. в окислительно-восстановительных реакциях. Это происходит при действии нитратредуктазы. Входя­ щий в состав данного фермента молибден сам взаимодействует с нитратом и затем с флавиновым ферментом, который, в свою оче­ редь, реагирует с содержащей НАД+ или НАДФ+ дегидрогеназой. Это ясно из схемы 20.

В-третьих, металл может обеспечивать сохранение вторичной, третичной и четвертичной структуры ферментного белка. В этом отношении прекрасным примером является а-амилаза. Все виды

112

Схема 20. Участие молибдена в действии нптратредуктазы

именно для поддержания вторичной и третичной структуры фер­ мента.

Лишенная кальция а-амилаза имеет такую же активность, как и нативный, содержащий кальций фермент. Это ясно видно из рис. 29. Этот же рисунок показывает, что фермент, лишенный кальция, крайне неустойчив, чрезвычайно легко денатурируется и теряет активность в результате двухчасовой инкубации при pH, отклоняющемся от оптимального.

Таким образом, при оптимальном pH вторичная и третичная структура фермента поддерживается благодаря водородным и другим дополнительным связям; при более кислой и более щелоч­ ной реакции среды на первый план в качестве фактора, стабили­ зирующего структуру фермента, выступает кальций.

Стабилизация структуры фермента под влиянием кальция про­ является также в том, что фермент, лишенный кальция, очень легко расщепляется протеолитическими фер,ментами. Это видно на рис. 30, показывающем активность а-амилазы, обработанной трип­ сином и этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА), который связывает

Время инкубации, часы

Рис. 29. Стабильность а-амнлазы Bacillus subiilis при инкубации в течение

двух часов при 25° и разных pH (по Э. Фишеру и сотр.)

1 — без Са2+; 2 — с Са2+

Рис. 30. Влияние ЭДТА и трипсина на а-амилазу Bacillus subiilis

(по Э. Фишеру)

1 — инкубация с трипсином; 2 — инкубация с ЭДТА; 3 — инкубация с ЭДТА и трипси­ ном (pH 7,5; 25°)

113

кальций, образуя с ним прочное внутрикомплексное соединение (хелат). Из рисунка также видно, что трипсин практически не расщепляет и-амнлазу;, однако если а-амилаза предварительно обработана ЭДТА, то она быстро расщепляется трипсином. Таким образом, кальций в данном случае играет роль фактора, предо­ храняющего а-амнлазу от расщепления протеолитическими фер­ ментами.

Что касается роли металла в поддержании четвертичной структуры ферментного белка, то в этом отношении хорошим при­ мером является дрожжевая алкогольдегндрогеназа. Этот фермент имеет молекулярную массу 151 тыс., содержит четыре атома цинка в молекуле и четыре молекулы НАД1'. Удаление цинка из мо­ лекулы алкогольдегидрогеназы вызывает не только её инакти­ вацию, но и диссоциацию ферментного белка на четыре неактив­ ные субъединицы с молекулярной массой 36 тыс. каждая.

Наконец, четвертый возможный способ действия металла — когда металл способствует соединению апофермента с коферментом. Подобное действие металла наблюдается в случае алкогольдегидрогеназы (см. схему 29) и глицеральдегидфосфатдегидрогеназы.

Заканчивая раздел, посвященный роли металлов в фермента­ тивном катализе, нужно подчеркнуть, что за последние годы все чаще выявляется, что тот или иной металл в незначительных коли­ чествах играет важную роль в ферментативных реакциях. Роль так называемых микроэлементов в обмене веществ растений и животных как раз и заключается в том, что они необходимы для построения и нормального функционирования целого ряда фер­ ментов .

Все это еще раз свидетельствует о том, что различные стороны обмена веществ неразрывно связаны между собой — недостаток или нарушение обмена какого-либо металла в растительном или животном организме сразу же сказывается на действии того или иного фермента, вызывая соответствующее заболевание.

Л и т е р а т у р а

Коферменты. Под ред. нроф. В. А. Яковлева. М., «Медицина», 1973. Любимов В. И. Ферредоксины н их биохимическая роль.— В сб. «Успехи

биологической химии» т. 7. Под ред. Б. И. Степаненко. М., «Наука», |1965, стр. 176.

Лейве Я . В. Роль металлов микроэлементов в биохимических процессах,

катализируемых ферментами.— Известия АН СССР, серия биол., 1967,

№ 1, 11.1

Пейве Я . В. Микроэлементы и биологическая фиксация азота. XXXI Тими­

рязевское чтение. М., «Наука», 1971.

Химия и биология пиридоксалевого катализа. Труды II Международного симпозиума. М., «Наука», 1968.

Anion D. I. Ferredoxin and photosynthesis.— Science, 1965, 149, 1460. Buchanan В. B., Arnon D. Ferredoxins: Chemistry and function in photosyn­

thesis, nitrogen fixation and fermentative metabolism.— Advances Enzymol., 1970, 33, 119.

'114

Г л а в а 5

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ

Как известно, химическая кинетика является учением о ско­ ростях химических реакций. Скорость химической реакции опре­ деляется количеством веществ, прореагировавших за единицу времени. Ферментативная кинетика занимается изучением зако­ номерностей влияния химической природы реагирующих веществ и условий их взаимодействия иа скорость ферментативных реак­ ций. Количественные соотношения, характеризующие влияние раз­ личных факторов на кинетику ферментативной реакции, позво­ ляют высказать гипотезы относительно механизма действия дан­ ного фермента и исключить из рассмотрения гипотезы, не соот­ ветствующие установленным закономерностям.

Скорость химических реакций, в том числе и ферментативных реакций, зависит прежде всего от химической природы реагирую­ щих веществ.

Так, например, расщепление каким-нибудь протеолити­ ческим ферментом разных белков происходит с разной ско­ ростью, поскольку скорость этой реакции зависит от химической природы расщепляемых белков.

Далее, скорость ферментативной реакции зависит от концен­ трации самого фермента и от концентрации реагирующих ве­ ществ .

Важным фактором, определяющим скорость ферментативной реакции, является температура. Скорость ферментативной реакции увеличивается с повышением температуры. Однако это повыше­ ние происходит лишь до определенного предела, когда начинает­ ся разрушение белка, его денатурация.

Поскольку многие ферменты содержат коферменты, т. е. ор­ ганические соединения небелковой природы, необходимые для действия фермента, очевидно, что скорость ферментативной реак­ ции зависит и от концентрации коферментов. Как мы уже указы­ вали ранее, наряду с коферментами для действия многих фермен­ тов необходимы некоторые металлы. Поэтому скорость фермен­ тативных реакций зависит от концентрации этих кофакторов. Скорость ферментативной реакции в значительной степени за­ висит также от pH.

Наконец, скорость ферментативной реакции зависит от при­ сутствия в данной клетке или растворе различных активаторов или ингибиторов ферментов.

11(3

Ферментативные реакции подчиняются закону, согласно которому реакция идет тем быстрее, чем больше концентрация

Таким образом, ѵ+1, т. е. скорость прямой реакции, равна /с+1, умноженному на концентрацию вещества А и концентрацию ве­

природу реагирующих веществ, их способность вступать в данную реакцию. Константа скорости реакции равна скорости реакции при концентрациях реагирующих веществ, равных единице.

Если имеет место химическое равновесие, то при этом скорости

Иначе можно написать:

*+і[А]-[В] = * _ ! [С]-[Г>].

Это выражение можно преобразовать так:

ной реакции (от латинского equilibrium, что значит равновесие). Таким образом, константа равновесия реакции равна произ­ ведению концентраций образующихся веществ, деленному на произведение концентраций исходных веществ, в состоянии рав­

новесия.

Иначе говоря,

117