книги из ГПНТБ / Кретович В.Л. Введение в энзимологию

НО— с—СН2 н2с— с- ом

Оо

Важно подчеркнуть, что протогематин одинаков как в ката­ лазе, так и в пероксидазе, хотя эти ферменты катализируют, со­ вершенно разные реакции. Различие функций данных ферментов зависит от белка, с которым связан гем. Это прекрасный пример того, что белок, соединяясь с одним и тем же коферментом, опре­ деляет специфичность действия данного фермента.

Железо в виде гема железопорфиринового комплекса содер­ жится также в различных компонентах ферментной системы, участвующих в окислительных процессах в клетке и объединяе­ мых под названием ц и т о х р о м н а я с и с т е м а . Цитохромы были открыты Д. Кейлином и затем найдены у всех организмов, за исключением облигатно-анаэробных бактерий, т. е. таких, для которых кислород является ядом. Однако недавно цитохромная система была обнаружена также у некоторых облигатно-анаэроб­ ных бактерий. Цитохромная система состоит из различных цитохромов, а также фермента цитохромоксидазы, активирующего молекулярный кислород и с его помощью окисляющего восстанов­ ленный цитохром. В настоящее время открыт целый ряд цито-

4* 99

Хромов, различающихся по спектрам поглощения, по сродству Й молекулярному кислороду и химической природе гема. Они полу­ чили название цитохром а, цитохром Ь, цитохромы с и с1, цито­ хром Д, цитохромы fc0, b3, 67, а3 и т. д. Для того чтобы избежать путаницы в номенклатуре цитохромов, Международная комиссия по классификации и номенклатуре ферментов предложила разде­ лить все известные цитохромы на четыре группы, в зависимости от природы гема.

Эти группы следующие: цитохромы а — содержат железоформилпорфирин, цитохромы b — железопротопорфирин, цитохромы с — замещенный железомезопорфирин с ковалентными связями между белком и порфирнном и цитохромы d — содержат железодигидропорфнрин.

d

Порфирины цитохромои а, b, с, d

100

Рис. 26. Кристаллический цптохром с из пшеничных зародышей (восстанов­

ленная форма); ув. в 400 раз (по К. Окунукн)

Многие цитохромы получены в кристаллическом состоянии

(рис26).

Белковые компоненты цнтохромов представляют собой низко­ молекулярные белки. Связь гема с белком, как это видно на схе­ ме 13, может осуществляться ковалентными связями через серу двух остатков цистеина, содержащихся в белке, а также с помощью дополнительной связи между атомом железа и остатком гистидина (в цитохромах с).

Для ряда цнтохромов полностью установлена первичная структура белкового компонента. На схеме 14 приведена первич­ ная структура белкового компонента цитохрома с из плесневого гриба Neurospora. Роль цнтохромов в живой клетке состоит в том,

Схема 13. Присоединение гема к полипептиду в цптохромс с пз дрожжей

(по Г. Туппп)

101

10

1І.Л’-Гли-Феи-Сер-Лл-Гли-Ас-Сср-Лиз-Лиз-Гли-Ал- Ас N-Лей-Фен-Лиз -Г1£М-

— Ил-Лпз-ГлГч'-Тре-Лей-Ас^Глн-Гли-Глю-Глн-Гпс-Цис-Глю-Лл-Цнс-Лр г-Тре—*

1— Гли-П ро- Ал-Лей-Гпс-Глн-Лей-Фсн-Гли-Арг- Лиз-Т ре-Гли-Сер-Вал-Ас—

I— Трн-Трс-Ил-Гли-Лнз-Глі^-Лиз-ЛеІ^-Ал-Лс-Тре-Тир-Лл-Тнр-Гліі

L

1— Ас-Глю- AcN-Tpc-Лен-Фен-Глю-Т пр- Лей-Глю-АcN-При-.Пиз-----

—Лнз-Леп-Глн-Глн-Фен-Ал-Мст-Лнз-Тре-Глн-Про- Ил-Т ир-Лнз—*

ЦХ)

'—Лііз-Ас-Лиэ-Ас-Арг-АсіЧ’-Ас-Ил- Ил-Тре-Фен-Мет-Л из—

! ЮОС-Ал-Тре^* Ал-Г лго—*

Схема 14. Первичная структура белкового компонента цитохрома с нз плес­

невого грнба Neurospora (по Д. Геллеру п Э. Смиту)

Цифры — номера ашшошіелотных остатков

что их окисленные формы воспринимают электроны от водород­ ных атомов, отнятых дегидрогеназами от окисляемого субстрата и содержащихся в дпгпдроформе флавиповой дегидрогеназы. В результате этн водородные атомы превращаются в ноны водорода Н+, а цптохром пз окисленной формы переходит в восстановлен­ ную, причем содержащееся в нем железо пз трехвалептного пре­ вращается в двухвалентное. В дальнейшем отнятый от водородного атома электрон передается кислороду, который при этом приобре­ тает способность реагировать с иоипзпроваинымн водородными атомами, образуя воду. Как мы уже отмечали, окисление восста­ новленных цитохромов осуществляется ферментом цитохромоксидазой, который также представляет собой гемопротеид (цито­ хром а3). Цитохромоксидаза ингибируется синильной кислотой и окисыо углерода. Этп ингибиторы, связываясь с железом фермен­ та, лишают его каталитической активности, причем в результате у многих клеток дыхание угнетается на 80—90% . Окись углерода

Схема 15. Участие цитохромной системы и клеточном дыхании

102

Рис. 27. Кристаллы быстро и .медленно движущегося компонента летоглобина (по Н. Эльфольку)

л — быстро движущийся компонент (ув. в 650 раз); б — медленно движущийся компо­ нент (ув. в 2J0 раз)

является ингибитором цптохромокепдазы лишь в темноте. Это объясняется тем, что соединение окиси углерода с железом легко разлагается на свету. Ролъ цитохромиойсистемы в дыхании клеток может быть представлена в виде схемы 15.

В переносе электронов от водородных атомов в процессе ды­ хания последовательно участвуют цитохром Ь, цитохром сх, цитохром с, цитохром а и, наконец, цитохром а 3 (цитохромоксидаза).

Как видно из схемы, которая иллюстрирует роль цитохромной системы в дыхании клеток, между флавиновым ферментом и ци­ тохромной системой разыгрываются окислительно-восстанови­ тельные реакции, в которых участвуют убихинопы (см. стр. 63) и белки, содержащие негеминовое железо. На последнем этапе переноса электронов, в котором принимают участие цитохромы

аи а3, по-видимому, участвуют также ноны меди.

Вклубеньках бобовых растений, которые, как известно, об­ ладают способностью усваивать молекулярный азот атмосферы, содержится гемопротеид, названный легоглобином (гемоглобин бобовых Leguminosae). Ои играет важную, но пока еще неясную роль в процессе фиксации молекулярного азота, и его содержание

вклубеньках тесно связано с их способностью к усвоению азота атмосферы. Обычно клубеньки бобовых содержат около 4% легоглобииа на сухой вес. Путем электрофореза удалось показать, что легоглобин состоит пз двух компонентов — более быстро движу­ щегося и более медленного. Оба эти компонента получены в кри­ сталлическом состоянии и изображены на рис. 27.

103

в нем — 0,29%. Приближаясь по своему аминокислотному соста­ ву к гемоглобином некоторых животных, эти компоненты легоглобпиа вместе с тем немного различаются по содержанию некоторых аминокислот.

Исключительно важным и интересным является вопрос, благо­ даря какому молекулярному механизму легоглобин участвует в процессе фиксации азота атмосферы.

3 II а ч е и и е м е т а л л о в д л я д е й с т в и я ф е р- м е н т о в . Наряду с коферментами в создании каталитической активности ферментов важную роль играют различные металлы — железо, медь, марганец, магний, калий, цинк, молибден.

Каким образом можно установить, что тот и л и и н о й металл необходим для действия данного фермента? Ценные указания в этом отношении могут быть получены уже в чисто физиологи­ ческих опытах. Так, например, было показано, что недостаток в ппще молибдена и железа вызывает резкое снижение активности ксантнноксидазы в печени крыс, а добавление этих элементов в диету восстанавливает нормальную активность фермента. Точно так же недостаток в питательной среде молибдена приводит к рез­ кому снижению активности шітратредуктазы у плесневого гриба

Neurospora crassa-

Совершенно очевидно, однако, что результаты подобных физио­ логических опытов являются лишь косвенным указанием па уча­ стие того или иного металла в построении молекулы фермента; для окончательного решения вопроса необходимо исследовать вы­ сокоочищенный препарат данного фермента. Действительно, ис­ следование высокоочшцеппых препаратов ксантнноксидазы и нитратредуктазы показало, что в составе первой из них содержатся прочно связанные молибден и железо, а в составе второй — мо­ либден.

Исследование очищенных ферментных препаратов на воз­ можное наличие в них того или иного металла может быть сделано следующим образом:

1.Получив чистый препарат фермента, нужно определить пу­ тем анализа, содержит ли он металл.

2.Определить, отщепляется ли данный металл при диализе.

3.Испытать действие на фермент специфических реактивов, связывающих данный металл.

Втабл. 1 приведены примеры участия металлов в некоторых

ферментативных реакциях и указано, насколько прочно тот или иной металл связан с ферментом.

Как видно из табл. 1, к числу ферментов, активируемых метал­ лами, но могущих действовать и в отсутствие металла, относятся лейцинамииопептидаза и фосфопируват-гидратаза.

Вторая группа — это металлоэнзимы, т. е. такие ферменты, которые пе действуют без металла. Эта группа включает так на­ зываемые диссоциирующие металлоэнзимы, т. с. такие металло­ энзимы, от которых легко отщепляется металл. К ним прииад-

1U4

лежат ыитратредуктаза, а также пероксидаза и каталаза, в состав которых входит железо в виде железопорфпрпиового комплекса. Сюда же относится а-амнлаза- Она содержит кальций и катали­ зирует реакцию гидролиза крахмала.

К числу металлоэизимов относятся также недиссоциирующие металлоэизимы, которые, в свою очередь, могут быть подразделе­ ны на две подгруппы. Первая из них— это ферменты, ннгибируе-

105

Мые специфическим реактивом иа металл. В эту подгруппу входит, например, алкогольдегидрогепаза, содержащая цинк. Вторая подгруппа— ферменты, не пнгпбируемыѳ специфическим реакти­ вом на металл. Сюда относится сукциыатдегидрогеиаза, для дей­ ствия которой необходимо железо, и ксантиноксндаза, содержащая железо и молибден.

; Нужно сказать, что классификация, приведенная в табл. 1, в высшей степени условна, поскольку имеются постепенные пере­ ходы между ферментами, ингибируемыми и не ингибируемыми специфическими реактивами, между диссоциирующими и педнссоцпирующимп металлоэизпмамн.

Для связывания металлов в ферментах используются различ­ ные реактивы.

Типичным примером подобных ингибиторов являются 1,10-феиаитролин и 8-окспхпиолпп, очень прочно связываю­ щие металлы путем образования с нпми устойчивых внутрикомшіексных соединений (хелатов).

1,10-Феиантролнн 8-Оксііхтюлнн

Реактивом, который употребляется для связывания меди, яв­ ляется диэтплдитпокарбамат. Широко применяемые ингибиторы ферментов, содержащих медь п железо,— синильная кислота (HCN) и ее соли. Однако, говоря о синильной кислоте и диэтилдитиокарбамате, пужно помнить, что они не могут рассматриваться как специфические ингибиторы ферментов, содержащих железо и медь, поскольку в настоящее время установлено, что эти соеди­ нения ингибируют также некоторые не содержащие металлов ферменты.

В последние годы у ряда анаэробных бактерий, в хлоропластах высших растений и у фотосинтезирующих бактерий открыты пере­ носчики электронов, названные ф е р р е д о к с и п а м и . Эти кофакторы представляют собой железосодержащие белки, в ко­ торых железо содержится в иегемпиовой форме. Они имеют очень низкий окислительно-восстановительный потенциал, приближаю­ щийся к потенциалу водородного электрода. Так, ферредоксин, выделенный из хлоропластов шпината, имеет ЕД = —432 мв при

pH 7,55, а ферредоксии Clostridium pasteurianum Ej = —417 мв при pH 7,55Ряд ферредоксинов получен в кристаллическом со­ стоянии, как например, ферредоксин пз фотосинтезирующей бак­ терии Chromatium, имеющий молекулярную массу 9240 и изобра­ женный на рис. 28.

1U6

Рис. 28. Кристаллический ферредоксші фотосинтезирующей бактерии Chromatium, ув. 785 раз (по Б. Бюкенену, Р. Вакофену п Д. Арнопу)

Ферредоксші азотфиксирующей анаэробной бактерии Clostri­ dium pasteurianum имеет молекулярную массу около 6 тыс. и со­ стоит из остатков 55 аминокислот, в том числе 8 остатков цистеина. Молекула этого ферредоксина содержит 7 атомов железа, свя­ занных с остатками цистеина. Последовательность аминокислот-

107