книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

цитохромов, чем митохондрии растений, а общее количество цитохромов составляет 2,5% в расчете на сухой вес [679]. Показано, что количество каждого из цитохромов группы (Ь3 и Ь6) в хлоро­ пластах вдвое больше, чем Цит / [680]. Одна молекула Цит / приходится на 400 молекул хлорофилла [682].

В опубликованных позднее результатах исследований Сиронваля и Энглерта-Дьюардина [873], Джеймса и Лича [552] и Биггинса и Парка [235] с использованием хлоропластов из шпината или бобов содержание цитохромов /, be и Ь3 и отноше­ ние концентраций хлорофилла и цитохромов оценено несколько по-разному. Подтвердить же наличие Цит с в хлоропластах с по­ мощью этих методов не удалось.

По Боардману и Андерсон [247], в хлоропластах шпината молярные отношения Цит /554, Цит 66563 и Цит 63559 состав­ ляют 1 :2 :2 и одна молекула Цит f приходится на 430 молекул хлорофилла; І а, Цит Ь6 и Цит Ь3 в сумме — на 118 молекул хло­ рофилла; вычисления были сделаны после экстракции хлоро­ пластов ацетоном, что вносило некоторые ошибки в расчеты.

Вместе сітем недавно было высказано предположение [225]

другого— близок к нулю. Эти данные еще нуждаются в под­ тверждении: Однако хлоропластный Цит 6559 не имеет ничего об­ щего с митохондриальным Цит 6559, описанным Шихи и Хакеттом [864].

Какие же*функции выполняют цитохромыf, Ь6.и Ьг в хлоро­ пласте? В-L954'. г. Люндегардом [677] и в 1955 г. Дюйсенсом [351] впервые были опубликованы данные об окислении Цит f. К настоящему времени факт окисления Цит f в хлоропластах высших растений при действии ДК-света на зеленые клетки представляется четко установленным.

Витт с сотр. [1004], Чане и Боннер [290, 255] описали ини­ циируемые .^ДК-светом абсорбционные изменения в изолирован­ ных хлоропластах при температуре жидкого азота *, причем из­ мерялись дифференциальные спектры свет минус темнота в об­ ласти 555 нм. По мнению авторов, эти изменения отражают фотоокислениё Цит f; таким образом, Цит f находится в тесном контакте с реакционным центром ФС-І.

Позднее Чане с сотр. [292] пришли к выводу о существова­ нии в интактных листьях определенного «барьера» между П700 и Цит f. Они наблюдали некоторую задержку в окислении Цит f по сравнению с окислением П700 при 77° К; характер от­ ношений между Цит f и П700 не вполне понятен до настоящего времени.

* Одним из достоинств метода исследования реакций при низких темпе­ ратурах является возможность вычленения узких участков ЭТЦ возле реак­ ционных центров, так как ферментативные реакции при этих температурах не происходят.

В 1964 г. Румберг [825, 826] сообщил об относительно бы­ стрых (менее 0,1 сек) изменениях поглощения при освещении фрагментов хлоропластов шпината ДК- и БК-светом высокой интенсивности в области поглощения цитохромов. До начала ос­ вещения ДК-светом П700 и Цит / были окислены. В ходе даль­ нейшего освещения Б К- + ДК-светом П700 и Цит f оставались в окисленном состоянии. Изменение экстинкции в области поло­ сы Соре дало основание Румбергу сделать заключение, что Цит Ь восстанавливается ФС-ІІ. Восстановление Цит b (в отли­ чие от окисления Цит /) тормозилось при низкой температуре. При выключении БК-света Цит b быстро реокислялся. Это по­ служило основанием считать, что Цит b действует в роли пере­ носчика между обеими фотосистемами. В определенной степени эти работы, выполненные в лаборатории Витта до 1965 г., с некоторой натяжкой подтверждали существование двух фото­ систем. Однако Румберг был вынужден поместить Цит b в бо­ ковую цепь переноса, так как реокисление Цит b происходит

в10 раз медленнее, чем восстановление Цит f.

В1966 г. Хайнд и Олсон [505] также сообщили об измене­ ниях окислительно-восстановительного состояния цитохромов е- хлоропластах шпината по данным измерений их экстинкции в

области полосы Соре и а-полос. При действии ДК-света (705 нм) наблюдалось обычно окисление Цит /. Цит Ь6 восста­ навливался как БК-светом (670 нм), так и ДК-светом (705 нм). Единственная полоса, появлявшаяся при включении БК-света, четко относилась к изменению именно при 442 нм (Цит / ) .

Изменения, наблюдавшиеся при 436 ям, расшифровать ока­ залось трудно, но изменения Цит Ьв явно не поспевали за изме­ нениями, обусловленными Цит /. Фактически эти авторы при­ соединились к Румбергу, заключив, что Цит Ь6 не находится на главном пути переноса электрона между фотосистемами. Тем не менее в 1965 г. сам Румберг сообщил [825], что электрон пе­ реносится от Цит Ь6 на Цит /, так как Цит Ь6 быстро восстанав­ ливается светом, поглощаемым ФС-П.

Известным разъяснением этого вопроса можно считать рабо­

восстанавливался при действии света, причем продолжительное освещение приводило к медленному его окислению до некоторо­ го стационарного уровня, а выключение света усиливало окисле­ ние цитохрома. Включение БК-света вызывало обратный пере­ ход в сторону восстановления до первоначального уровня, при­ чем Цит Ьз восстанавливался сильнее, чем Цит bs.

Удалось установить интересную закономерность: максимумы цитохрома оказываются при 563 нм или 560 нм, в зависимости

Пластохяноны. В ходе исследований, проводимых в послед­ ние годы, пытаются выяснить количественный состав и роль отдельных Пх в ЭТЦ и реакциях ФФ и отношение Пх к Q.

Дотнед.

9/Пх-9/), спектр которого в окисленном и восстановленном сос­ тоянии показан на рис. 17, является 2,3-диметил-5-солянозилбен- зохиноном:

о

Пх-9 относится к весьма многочисленной и разнообразной группе веществ, экстрагируемых в составе смеси разнообразных липидов и липохинонов из высушенных в замороженном состоя­ нии хлоропластов с помощью легких или средних фракций угле­ водородов (петролейного эфира, гексана, гептана), причем прак­ тически нет способов избирательно извлекать из хлоропластов те или иные липиды или хиноны.

Липохиноны обнаружены не только в тилакоидах, но и в осмиофильных пластоглобулах внутри стромы пластид. Количество хинонов в хлоропластах, выделенных даже из одного растения, •сильно колеблется, проявляя тенденцию к увеличению в ходе ро­ ста растений, а также при постоянном освещении. По мнению Лихтенталера, в пластоглобулах хлоропластов зрелых листьев содержится избыток хинонов, причем пластоглобулы могут со­ держать более половины всех хлоропластных хинонов [663].

В 1969 г. Крамер и Батлер на основе анализа своих работ и

то Е'о Q определен величиной — 35 мв [319].

Несколько ранее Кок и Малкин [706] установили, что гипоте­ тический восстановитель ФС-ІІ находится в небольших количест­ вах по сравнению с общим пулом Пх: 1 молекула Q на 150 моле­ кул хлорофилла. Очевидно, лишь один из представителей группы Пх служит общей ловушкой, подобно тому как обстоит дело с П700; функции остальных хлоропластных хинонов, кроме Пх, пока не выяснены [663]. Витт установил связь изменений редокс-состо- яния Пх с изменениями П700 и рассчитал, что отношение пула Пх к пулу П700 при высоких интенсивностях света составляет 6 : 1 . Витт и его сотр. на основании изучения кинетики изменений по­ глощения, приписываемых Пх и ГЇ700, пришли к заключению, что нет принципиальных различий между Q и Пх. (Кок с этим не со­

ЭТЦ: 1 молекула Пх приходится на 10 молекул Хл. Поэтому только часть Пх вовлекается в абсорбционные изменения.

Пигмент П700. Самая общая характеристика этого пигмента как формы Хл а дана на стр. 19. Однако здесь мы рассматрива­ ем П700 в другом функциональном аспекте — не как ловушку фо­ тонов, а как переносчик ЭТЦ в хлоропластах. В следующей час­ ти книги, при рассмотрении ПБЛВ-комплексов хлоропластов, П700 будет снова рассматриваться, но уже как реакционный центр ФС-І.

Кок [624], экстрагируя хлоропласты смесью 85% ацетона с 15%' воды, показал, что, хотя экстрагировалось 5/6 всего хло­ рофилла, индуцируемые светом изменения П700 уменьшились только в два раза. Следовательно, П700 прочно связан с ламеллярной структурой хлоропласта. Успех в дальнейшей очистке П700 был достигнут [947, 1018] благодаря применению комби­ нированной процедуры обработки хлоропластов ацетоном и де­ тергентом тритоном Х-100. Следует заметить, что другие органиче­ ские растворители инактивируют абсорбционные изменения П700.

Показано, что хлоропласты, обработанные при определенных условиях [832, 599] тритоном Х-100 или дигитонином, при дей­ ствии света обнаруживают абсорбционные изменения, относящи­ еся к П700, но не к цитохромам.

Значительной очистки частиц, содержащих П700, т. е. реакци­ онных центров ФС-І, удалось добиться при использовании как хлоропластов шпината, так и синезеленых водорослей, причем в последнем случае — из мутантов, лишенных каротиноидов и рас­ тущих на среде с дифениламином [780, 781, 940].

Кок обнаружил абсорбционные изменения длинноволновой формы Хл а при 700 нм, а позднее Витт [1006] показал, что из.-

менения в области полосы Соре при 443 нм также относятся к П700.

695 — совершенно разные формы. Относительное содержание по­ следней составляет около 5%, а П700—только 0,3% всего Хл а.

Отметим, что на живых клетках в условиях продолжительного освещения изменения, обусловленные П700, изучать трудно. Ко­ личество этой формы Хл а, как видим, незначительно, и ее изме­ нения перекрываются изменениями основной массы Хл а, а так­ же искажаются вследствие сдвига Стокса. Наиболее важные результаты были получены только при относительно низкой ин­ тенсивности возбуждающего света, т. е. при уменьшении выхода флуоресценции, и с применением спектрально достаточно узких источников освещения.

Абсорбционные изменения, обусловленные П700, более резко проявляются после «старения» хлоропластов, при потере ими способности выделять кислород и с использованием электронодонорной пары АК — ДХФИФ, после экстракции петролейным эфиром или гексаном, а также при охлаждении до очень низких температур [1006].

Одно время казалось доказанным, что изменения поглощения, обусловленные окислительно-восстановительными превраще­ ниями П700, находятся в прямой связи с изменениями, зависящи­ ми от Цит f, а последний рассматривался как донор электрона для П700 при действии ДК-света. Значение редокс-потенциа- лов и молярное соотношение (1:1) этих пигментов, наконец обна­ ружение обоих компонентов внутри одного и того же пигментбелкового комплекса, относящегся к ФС-І,— все, казалось, слу­ жило тому веским доказательством. Связь их внутри ламелл весьма прочна: для выделения Цит / необходимы жесткие воз­ действия, а П700 до сих пор удается только значительно очис­ тить, но не изолировать в чистом виде.

Исследование абсорбционных изменений П700 обнаруживает картину, характерную для Цит f, за исключением той особен­ ности, что выключение ДК-света (730 нм) вызывает относитель­

сильного восстановления, а выключение возвращает изменения к исходному уровню или не меняет картины абсорбционных измене­ ний. Таким образом, П700 очень четко обнаруживает свое место между двумя фотосистемами. Уменьшение поглощения в области 700 нм без освещения можно вызвать, внеся в систему сильный окислитель, например феррицианид,— доказательство того, что именно окисление П700 (а не восстановление!) связано с умень­ шением поглощения при 700 нм. Изучение кинетики окисления

вспышками БК-света на фоне постоянного освещения светом с длиной волны 700—730 нм низкой интенсивности обратное вос­ становление П700 происходило за время менее Ю - 4 сек. П700 окислялся и при температуре —150° С, но в этом случае обрат­ ное восстановление оказывалось заторможенным. Окисление П700 осуществляется посредством чрезвычайно быстрого фото­

растений с нормально функционирующими фотосистемами. Этот белок легко выделяется из разных фотосинтезирующих организ­ мов, так как связи его внутри пигмент-белковых комплексов не­ прочны.

Концентрированный раствор окисленной формы Пц, спектр которой представлен на рис. 18, имеет голубой цвет, восстанов­ ленной — бесцветный. При хранении Пц в водном растворе медь довольно быстро освобождается, вследствие чего биологическая

и более быстрое обратное восстановление при выключении све­ та. Настораживала только (с позиций участия Пц в роли пере­ носчика между фотосистемами) относительно медленная ско­ рость окислительно-восстановительных превращений. Полупе­ риод (г0 ,5 ) окисления ДК-светом составлял 0,1 сек, обратного

зумеется, этот факт явился весьма существенным доводом в пользу представлений о функционировании Пц между фотосис­ темами. Позднее на хлоропластах ульвы было показано, что салицилальдоксим снимает изменения при 591 нм, приписывае­ мые Пц, но не затрагивает окисления Цит /, хотя ингибирует его восстановление [383, 639]. Сходные результаты на хлоропластах

0,S\

Рис. 18. Спектр поглощения окисленной формы пластоцианина из листьев шпината (по Като с соавт. [593]).

шпината были получены Авроном [193]. Из этих данных, накоп­ ленных к Брухавенскому симпозиуму 1966 г., вырисовывалась та­ кая последовательность звеньев в ЭТЦ:

или с Цит f, заставили усомниться в правильности этой последо­ вательности.

Кроме того, был обнаружен весьма странный факт: редокспотенциалы Пц и Цит f практически равны.

Наконец, исследования Като и Сан-Пьетро [586] и Ренгера из лаборатории Витта [819] показали, что салицилальдоксим не является строго специфичным ингибитором по отношению к Пц. Требст [914], применив дисалицилиденпропандиамин, обнару­ жил, что этот ингибитор предотвращает восстановление Фд, не влияя на Пц. Кок с соавт. [635] после изучения ЭТЦ в обработан­ ных дигитонином хлоропластах с использованием экзогенного Пц, а также экзогенных Цит f из эвглены и Цит с из мышц животных пришли к заключению, что Пц и Цит f параллельно и равным образом переносят электроны на П700. Экзогенный животный Цит с служил в этой системе донором электрона.

В противоположность этому Весселс [979] сообщил, что при использовании фрагментов хлоропластов, утративших большую часть Пц и Цит f, только Пц восстанавливает способность к фо­ торедукции НАДФ+ при внесении в модельную систему с хло­ ропластами АК — ДХФИФ. Ускорение фотоокисления Цит f