книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

Ч а с т ь II

ЭЛЕКТРОНОТРАНСПОРТНАЯ ЦЕПЬ В ХЛОРОПЛАСТАХ ПРИ ФОТОСИНТЕЗЕ

Переходим к конкретному рассмотрению работы ЭТЦ в хло­ ропластах. В 60-х гг. перенос электронов обычно рассматрива­ ли в рамках двухступенчатой Z-схемы. Трехступенчатая схема принципиально отличается от двухступенчатой иным взаимо­ действием участников ЭТЦ.

Поглощение фотонов двумя или тремя качественно различны­ ми реакционными центрами инициирует перенос электронов. На­ помним, что в фотохимических центрах поглощенная световая энергия превращается в химическую энергию в виде пары вос­ становитель — окислитель, разность потенциалов между которы­ ми превышает разность потенциалов между первыми из обна­ руживаемых относительно стабильных веществ. Энергии одного

сравнению с другими выделенными из хлоропластов вещества­ ми, значением редокс-потенциала. Поэтому его часто называют первичным окислителем ФС-І. Однако ниже будут приведе­ ны доказательства образования гипотетического вещества, абсо­ лютное значение редокс-потенциала которого еще ниже, чем Фд.

Обсуждая работу ЭТЦ при фотосинтезе, мы последователь­ но рассмотрим три процесса: 1) реакцию между первичным окислителем ФС - И и Н 2 0 , приводящую к выделению кислорода; 2) перенос электронов между первичным восстановителем Ф С - П и первичным окислителем ФС-І в рамках двухступенчатой схе­ мы; 3) перенос электронов с первичного восстановителя ФС-І X на НАДФ+. Такое весьма условное разделение оказывается до­ статочно удобным при изложении материала.

Ниже приводятся аргументы в пользу двух (а не одной!) фотосистем при фотосинтезе (эти аргументы частично были сум­ мированы в обзоре Вернона и Аврона [937]; некоторые из них будут рассмотрены нами подробнее).

1.В опытах с хлореллой и анацистисом наблюдалось повы­ шение скорости фотосинтеза при добавлении света, поглощае­ мого ФС-І, к свету, поглощаемому ФС-П, и наоборот (эффект усиления).

2.При измерении фоторедукции НАДФ+ в хлоропластах

вен с этой электронодонорной парой: квантовый расход без нее равен примерно 2.

3. Выход флуоресценции при действии ДК-света низкий, БК-свет этот уровень увеличивает.

4.ДК-свет вызывает окисление, а БК-свет — восстановление Цит /.

5.ДК-свет стимулирует окисление, а БК-свет—восстановле­ ние Пц в опытах с водорослью ульвой и хлоропластами.

6. Выход люминесценции снижается при действии ДК-света

ивозрастает при действии БК-света.

7.ДК-свет вызывает окисление П700, выражаемое в умень­ шении поглощения, БК-свет вызывает обратный эффект.

8. На хлоропластах шпината показано, что ДК-свет вызыва­ ет окисление гидрохинона (увеличение поглощения при 254 нм). БК-свет вызывает восстановление хинона (уменьшение погло­ щения при 254 нм).

9. Действие ДК-света приводит в анаэробных условиях к увеличению, а в аэробных условиях к уменьшению абсорбцион­ ных изменений у хлореллы при 520 нм. БК-свет действует про­ тивоположным образом.

10. В анаэробных условиях при действии ДК-света и при ре­ акции ФФ с ФМС спектр действия обнаруживает максимум при 710 нм. БК-свет менее активен. В аэробных условиях разница в действии БК- и ДК-света на ФФ с ФМС сглаживается. ФФ, катализируемое Фд, при действии ДК-света в анаэробных усло­ виях обнаруживает черты ЦФФ. При действии БК-света Фд катализирует НФФ в присутствии НАДФ в качестве акцеп­ тора.

11. Реакции, обусловленные воздействием ДК-света, иници­

фоторедукции. При действии диурона, который препятствует пе­

от молекулярного водорода с участием гидрогеназы. В этих слу­ чаях фиксация С 0 2 не тормозится у адаптированных к водороду •водорослей даже при наличии диурона.

13.В реконструированных особым образом ЭТЦ ДК-свет вы­ зывает окисление, а БК-свет — восстановление экзогенного жи­ вотного Цит с.

14.Удалось выделить пигмент-белково-липидно-водные ком­ плексы (ПБЛВ-комплексы), соответствующие ФС-І и ФС-П.

В частности, к 1961 г. убедительные экспериментальные дока­ зательства участия двух фотосистем в фотосинтезе получены в

ропластных цитохромов Ь$ и Ьг с позиций гипотезы Кнаффа и Арнона (см. стр. 82), а также при рассмотрении различных ас­ пектов реконструкции ЭТЦ с участием экзогенного животного Цит с.

1. ФОТОСИСТЕМА II II МЕХАНИЗМ РАЗЛОЖЕНИЯ ВОДЫ

знанным, что кислород выделяется в результате разложения во­ ды, но все доказательства этого положения носят косвенный ха­ рактер и основываются в значительной мере на сравнении изо­ топного состава выделяемого при фотосинтезе кислорода и исходной воды (см. [69]).

Исследованиями Виноградова, Кутюрина и других авторов показано, что изотопный состав кислорода, выделенного расте­ ниями, отражает динамику процессов освобождения кислорода воды в ходе фотосинтеза, а также процессов, приводящих к его обратному поглощению.

Первые работы, в которых были получены данные, экспери­ ментально подтверждающие такую точку зрения, проведены в

ложения воды при фотосинтезе рассматривается как уникальный пример биологического окисления, осуществляемого окисленной формой Хл а. Однако по вопросу о происхождении кислорода при фотосинтезе до недавнего времени обсуждались возможнос­ ти его выделения с участием непосредственно углекислоты, а не

толита — сложной формы перекиси—с последующим выделе­ нием кислорода при разложении этой перекиси [964—966, 146]:

Именно отсутствие ясных представлений о последовательнос­

торые необходимо решить для раскрытия механизмов выделе­ ния 0 2 в ходе фотосинтеза:

1. Что собою представляет окислительный эквивалент приокислении воды, сфокусированный в ловушке квантов?

2. Имеется ли свободное промежуточное соединение, интермедиат, при выделении 0 2 или же высвобождение 0 2 — резуль­ тат сопряженной работы механизмов, накапливающих в себе четыре окислительных эквивалента?

3. Что вовлекается в регуляцию и контроль электронного по­

низма окисления воды. Вопрос о первичном окислителе ФС-П связан с исследованием химической природы малоизученного пигмент-белкового комплекса. В некоторых работах его обозна­ чают Z.

Жолио и Кок предложили альтернативные гипотезы образо­ вания кислорода при разложении молекул воды. Эти гипотезы, а именно: четырехступенчатая квантовая модель Кока и модель выделения кислорода при объединенном действии двух квантов Жолио — достаточно сложны. Они изложены в обзоре Чиниэ- [304].

На первом этапе процесса окисления воды и выделения мо­ лекулярного кислорода вода вовлекается в особый пигмент-бел­ ковый комплекс, внутри которого происходит ее окисление. Та­ кая вода, по Кутюрину [69], приобретает особую структуру: молекулы воды и продукты их распада закрепляются в реакцион­ ных центрах, при этом возможность изотопного обмена с моле­ кулами «обычной» воды исключена. Замещение молекулами- «обычной» воды молекул структурированной воды происходит только на свету после потребления в результате разложения по­ следних на реакционных центрах.

На следующем этапе окисляется кислород воды. Было вы­ сказано предположение, что разложение воды внутри пигментбелкового комплекса осуществляется окисленной формой хлоро-

филла, обладающей достаточным потенциалом для этого и, кро­ ме того, высоким сродством к молекулам воды. Прямое участие ксантофиллов, флавинов или цитохромов в этом процессе пред­ ставляется маловероятным [69].

В фотогидролизе воды участвуют ионы марганца и хлора, роль которых, особенно последнего, в осуществлении кислород­ ного звена фотосинтеза остается мало понятной. Еще совсем не­ давно все доказательства о необходимости именно этих элемен­ тов для процессов выделения кислорода базировались на вполне достоверных данных физиологических опытов [138]. При не­ достатке марганца и хлора в среде выращивания растений функ­ ция выделения кислорода оказывалась нарушенной [553, 244].

Образование активного пигмент-белкового комплекса с мар­ ганцем нуждается в фотохимической активации посредством многоквантового процесса. Кок [58] считает, что по меньшей ме­ ре два фермента, содержащие марганец, причастны к выделе­ нию кислорода из воды. Относительное содержание Мп в одном из них составляет один-два атома на улавливающий центр, а во втором четыре-пять. Потеря марганца фотохимическим центром при нагревании приводит к прекращению фотогидроли­ за воды, но способность к окислению некоторых искусственных окислителей, которые могут заменить воду, еще сохраняется.

В ряде работ Мп++ рассматривается как донор электрона в изолированных хлоропластах [223]. Экзогенный Мп++, как пока­ зали еще в 1955 г. Кентен и Ман, окисляется при действии све­ та до Мп-н-1- [612]. Допускалось два пути окисления Мп++: по­ средством ЭТЦ и через промежуточный окислитель.

иферрицианидом:

Вэтой системе наблюдалось высокое отношение Фн /2е- , а в более ранней работе Бен-Хайима и Аврона [222] сделано за­ ключение, что для фотовосстановления феррицианида необходи­ ма только ФС-П, но не ФС-І. Хлоропласты, выделенные из рас­ тений, выращенных на среде с недостаточностью марганца, от­ личаются не только слабой активностью реакции Хилла (по выделению кислорода), но и резким изменением характера флуоресценции [616, 170].

Чиниэ и Мартин [308] отмечали два эффекта гидроксиламина, которые зависят от его концентрации: 1) восстановление гидроксиламином гипотетического окислителя, который в нор­

в присутствии Ю - 5 М диурона, может указывать либо на суще­ ствование побочного пути переноса электрона на Q, нечувстви­ тельного к диурону, или пути фотоокисления гидроксиламина посредством ФС-1, либо на относительно быстрое обратное окис­ ление Q, возможно, кислородом [640, 229].

Конкурентоспособным по отношению к естественному донору

Анализ результатов своих работ и литературных данных по действию ингибиторов на ФС-П и влиянию гидроксиламина на способность к поддержанию реакции Хилла позволил Изава, Хесу и Хайнду [535] изобразить в ЭТЦ места действия гидро­ ксиламина и некоторых других доноров на окислительной стороне ФС-И, между реакционным центром этой фотосистемы и водой следующим образом:

Указанная схема отражает результаты, полученные с приме­ нением различных субстратов и кофакторов механизма разло­ жения воды и восстановления окислителей, а также результаты изучения переменной и постоянной составляющих флуоресцен­ ции, которой придают важное значение при исследовании ФС-П [516, 556, 640, 440]. Показано, в частности, что, если «вытека­ ние» электронов из Q блокировать диуроном, уровень флуорес­ ценции повышается, тогда как при стимуляции активности ФС-1, например ДК-светом, уровень флуоресценции снижается.

Обсуждение теории флуоресценции применительно к биоло­ гическим объектам содержится в обзоре Батлера [278]. Подроб­ ный анализ исследований, выполненных до 1969 г., дан в обзоре Чиниэ [304].

В рамках двухступенчатой схемы (Z-схемы) ЭТЦ первичным восстановителем ФС-П является гипотетический фактор Q — ту­ шитель флуоресценции. Однако флуоресценция, обусловленная ФС-И, имеет несколько составляющих, и на восстановительной стороне ФС-П рассматривается несколько гипотетических пере­

ев

для пластохинонов (см. ниже) и П700, Е'0 которого приняли равным + 440 мв.

Итак, даже краткое рассмотрение механизма разложения во­ ды при фотосинтезе приводит к заключению, что он весьма спе­ цифичен, состоит из ряда стадий и очень лабилен.

2. ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНОВ МЕЖДУ ДВУМЯ (ИЛИ ТРЕМЯ?) ФОТОСИСТЕМАМИ

В переносе электронов между двумя фотосистемами участ­ вуют пластохчноны, цитохромы, пластоцианин и, возможно, дру­ гие, пока плохо изученные переносчики.

Казалось бы, рассмотрение ЭТЦ между двумя фотосисте­ мами целесообразно начать с пластохинонов, поскольку гипоте­ тический слабый восстановитель ФС-П близок к Пх. Однако выяснение функции Пх (как и Пц, и П700) в настоящее время неизбежно связано с исследованием окислительно-восстанови­ тельных превращений цитохромов. Кроме тог.о, Пх тесно связан с реакционным центром ФС-П, а П700 — с реакционным цент­ ром ФС-1. Еще недавно казалось, что хлоропластные цитохромы группы b занимают промежуточное положение. Следует, впро­ чем, подчеркнуть, что не приходится говорить о центральной роли какого-либо одного из переносчиков: каждый из них со­ вершенно необходим для протекания нормального хода фото­ синтеза.

Участие цитохромов в ЭТЦ. Уровень наших знаний о функ­ ции этих гемпротеидов в хлоропластах определяется уровнем технических средств для их изучения, прежде всего спектроско­ пической техники. Сокращение времени, необходимого для сня­ тия спектров, использование коротких вспышек света, примене­ ние лазерной техники [114] позволили к 1967 г. проводить изме­ рения за время порядка Ю - 8 сек при чувствительности 0,1% величины пропускания [1005]. В 50-е гг. в лабораториях Чанса [286, 288], Люндегарда [678], Дюйсенса [350, 351], Витта [998] были созданы высокочувствительные дифференциальные спектрофотометры [29], способные регистрировать изменения (менее 0,005 ед. оптической плотности) в рассеивающих объек­ тах, таких как хлоропласты или митохондрии.

Для получения качественной характеристики цитохромов в хлоропластах важное значение имеет их спектрофотометрическое изучение при низких температурах. Объекты замораживают до температуры кипения жидкого азота, причем перед заморажива­ нием в пробы вносят окислитель (феррицианид) или восстанови­ тель (гидросульфит) и до 50% глицерина.

В этих условиях разрешающая способность спектрофотомет­ ров увеличивается: наблюдается более четкое разделение и обо­ стрение пиков цитохромов. Низкотемпературные спектры, од-

нако, не применяют для количественного определения цитохромов, поскольку интенсивность пиков в зависимости от условий температуры может быть различной. Измерение абсорбционных изменений при низких температурах в последнее время получает широкий размах, так как при действии света удается разграни­ чить фотохимические процессы и ферментативные, зависящие от температуры, и установить связь между отдельными участни­ ками ЭТЦ.

Открытие цитохромов в хлоропластах, характеристика их окислительно-восстановительных потенциалов и данные об их превращениях при включении света, а также применение сравнительных методов и обнаружение определенной аналогии между ОФ, в котором участие цитохромов казалось доказанным, и ФФ — все это привело к заключению об участии цитохромов в энергетических актах при фотосинтезе. В нем нашла отражение предложенная в 1960 г. Хиллом и Бендолл [491] гипотеза, по­ зволившая объяснить функцию двух хлоропластных цитохро­ мов в рамках двухступенчатого процесса переноса электронов. Гипотеза рассматривает функцию хлоропластных цитохромов по аналогии с Цит b и Цит с животной клетки. При действии одно­

электрона на более высокую ступень. Темновая реакция между Цит / и Цит Ьв с переносом электрона по градиенту термохими­

Здесь X, Y — гипотетические первые акцепторы продуктов фотолиза воды, которые образуют относительно восстановлен­

Один из пионеров изучения цитохромов высших растений Люндегард рассматривал изменения при освещении хлоропла­ стов шпината при 550, 554, 556—558 и 562—564 нм как дока­ зательства наличия соответственно цитохромов с, f, Ьг и bs. Он подсчитал, что хлоропласты содержат в два-три'раза больше