книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

Недостатком этого приема является резкое снижение общего уровня освещения объекта при продолжительности периода ос­ вещения порядка миллисекунд. Измерения проводили, учитывая выделение кислорода в ответ на известное число повторных им­ пульсов. Можно подобрать такую скорость вращения диска, при котором темповая стадия оказывается завершенной в период между двумя последовательными импульсами.

рость выделения кислорода возрастает пропорционально энергии импульса света до определенного предела, а затем остается на одном уровне независимо от концентрации С 0 2 и температуры. Таким образом, выделение кислорода на вспышку в прерывистом свете быстро достигает той же величины, что и при постоянном освещении. Эта величина оказывается весьма малой. Подсчи­ тав количество молекул хлорофилла в суспензии и число погло­ щенных квантов света, соответствующее насыщению, при извест­

ло интерпретировано Гаффроном как подтверждение существо­ вания ФЕ [414].

Эрмантраут и Рабинович [358], исходя из представлений ки­ нетики, показали, что ограничение скорости выделения Ог вызва­ но медленной переработкой фотопродукта ферментами во вре­ мя темнового промежутка. Поэтому «выход фотосинтеза» опре­ деляется «пропускной способностью» ферментов, а не числом молекул хлорофилла. Однако вывод о том, что одна молекула реакционного («перерабатывающего», по Эмерсону) центра при­ ходится на 2500 молекул хлорофилла, не совсем точен: необхо­ димо внести поправку на число химических эквивалентов, содер­ жащихся в одной молекуле выделяемого кислорода [7], с учетом необходимости двухступенчатого поднятия электрона от воды до НАДФ+. Следовательно, один такой центр приходится на

2500 , ~

=г зоо молекул хлорофилла. Это соотношение подтверди­

лось при использовании других подходов.

В эволюционном аспекте подобная диспропорция между чис­ лом молекул-фотосенсибилизаторов и числом молекул-ферментов может быть легко объяснена. Нормальное протекание фотосинте­ тического процесса в условиях средних и низких уровней осве­ щения и довольно редких актов поглощения квантов отдельны­ ми молекулами хлорофилла обеспечивается избыточностью количества ловушек квантов — пигментов; только некоторые из многих молекул пигментов оказываются с «уловом». Поэтому био­ логически неоправданным было бы обеспечение каждой из таких ловушек индивидуальным «перерабатывающим» механизмом,

собственной энзиматической системой; кроме того, для таких ме­ ханизмов, попросту говоря, не хватило бы места. В итоге боль­ шое число молекул хлорофилла (от 100 до 1000) «обслуживае­ тся» только одним энзиматическим механизмом, превращающим энергию фотона в энергию химических связей.

Интерес представляет следующий вопрос: являются ли эти 300 молекул хлорофилла, составляющие одну ФЕ, понятием чис­ то условным, статистическим, т. е. способны ли молекулы хло­ рофилла передавать энергию задержанных фотонов л ю б о й свободной энзиматической системе или такие молекулы хлоро­

центр имеет свой морфологически выделенный ансамбль моле­ кул — сборщиков фотонов, передающих энергию возбуждения только своему центру.

Согласно представлениям Тумермана и Сорокина [132], Жолио и Кока [557], ФЕ ФС-П является статистической, неразде­ ленного типа, т. е. энергия электронного возбуждения мигрирует внутри более широкой области, чем та, которую занимает мор­ фологически определенная группа молекул хлорофилла, прихо­ дящаяся на один «перерабатывающий» механизм.

Спектр действия фотосинтеза и «эффект усиления». Под спек­ тром действия понимают отношение одной из функций фотосин­ теза, например выделения кислорода, к эффекту действия света сравнительно узкого спектрального состава (в идеале — моно­ хроматического света).

Максимальную скорость реакции фотосинтеза, например чис­ ло молекул выделенного кислорода, отнесенное к числу задер­ жанных квантов света, называют квантовым выходом. Други­ ми словами, квантовый выход — это число молекул на один фо­ тон. Величину, обратную квантовому выходу,— число квантов на одну молекулу — называют квантовым расходом или кванто­

вой потребностью.

Изучая на хлорелле спектр действия фотосинтеза> т. е. по­ следовательно измеряя величину квантового расхода вдоль шка­ лы длин волн, Эмерсон и Льюис [365, 369] установили весьма неожиданные закономерности. Метаболизм фототрофных штам­ мов хлореллы подчинен фотосинтезу, дыхание выражено слабо, и с этой точки зрения хлорелла напоминает изолированный хло­ ропласт [61,'146, 107]. Но при работе с живой водорослью от­ падает проблема сохранения нативных свойств; хлоропласт же вне клетки и целого растения очень скоро инактивируется. Од­ ним из удобств использования микроскопических объектов для исследований является возможность применения точных коли­ чественных методов измерений.

Эмерсон и Льюис в манометрических опытах с суспензией клеток хлореллы установили, что свет, поглощенный в сине-фио­ летовой области, относительно менее эффективен, чем в красной

области. Оказалось, что спектр действия фотосинтеза не совпа­ дает со спектром поглощения хлорофилла и, захватывая значи­ тельно более широкую область шкалы длин волн, попадает в область поглощения других пигментов. Это показывает, что до­ полнительные пигменты — Хл Ь, каротиноиды (а в красных во­ дорослях —• фикобилины) — эффективно поглощают свет. Тем не менее отсюда нельзя сделать прямой вывод, что дополнитель­ ные пигменты передают поглощенную энергию Хл а, а не ини­ циируют фотохимический процесс сами. Из рис. 7 видно, что квантовый выход резко падает при длине волны больше 680 нм (для хлореллы) и имеет заметный «провал» в области 660 нм.

Рис. 7. Зависимость квантового выхода от дли­ ны волны (по Эмерсону н Льюису [369]).

Этот результат не очень понятен до настоящего времени. Изуче­ ние квантового выхода имеет большое значение, так как поз­ воляет судить об эффективности работы фотосинтетического ап­ парата растений.

Исследователи школы О. Варбурга [963] определили, что ве­ личина минимального квантового расхода около 4 и даже мень­ ше. При затрате четырех квантов красного света на образова­ ние одной молекулы кислорода, что соответствует восстановле­

дователей считает, вслед за Эмерсоном, что более вероятна ве­

личина квантового расхода 8—10 [623].

Определение фотосинтеза как процесса, включающего два последовательных фотоакта, приводит к заключению о необхо­ димости двух квантов на перенос каждого электрона или же восьми квантов на молекулу кислорода. Если учесть необходи­ мость двух последовательных фотореакций для переноса каж­ дого электрона от воды к НАДФ+ и число химических эквива­ лентов в одной молекуле кислорода (четыре), то при такой ми­ нимальной величине квантового расхода поглощенные кванты

должны равным образом распределяться между обеими фото­ системами. При этом КПД фотосинтеза составит не 70, а 35%; вместе с тем, и это особенно важно для рассматриваемой нами проблемы — анализа и реконструкции фотосинтетического ап­ парата, полученная величина 8 свидетельствует, что на восста­ новление каждого из четырех эквивалентов выделения 0 2 или восстановления СОг требуется два кванта, а не один. Удивитель­ но, что по такому важному вопросу до настоящего времени не было достигнуто согласия!

В одной из последних работ Варбург с соавт. (1969 г. [966]) объясняют большой разброс значений квантового расхода тем, что необходимо якобы учитывать только «активную» часть хло­ рофилла. Тем не менее американские исследователи в работах, опубликованных в 1968 г. [441, 761], продолжают настаивать на величине между 8 и 12.

Выше отмечалось резкое падение квантового выхода у хло­ реллы при длине волны актиничного (эффективного) света более 680 нм. У красных водорослей это наблюдается в области выше 650 нм, где Хл а обладает максимумом поглощения. Казалось бы, на первый взгляд, последнее можно объяснить тем, что кванты красного света несут недостаточное количество энергии. Однако Эмерсон с соавт. в 1957 г. обнаружили замечательный эффект: «неактивные» кванты света (с длиной волны больше 680 нм) для хлореллы становятся полностью активными при до­ полнительном облучении более коротковолновым светом, напри­ мер при сочетании света с длиной волны 700 и 650 нм [365]. Количество образованного 0 2 в этих условиях значительно пре­ вышает суммарное количество Ог, образованного при действии тех же лучей порознь.

Этот феномен получил название «эффекта усиления», так как сначала полученные данные были расценены как факт повыше­ ния фотосинтетической эффективности дальнего красного света (ДК-света). Эффект усиления (Е) можно определить как отно­ шение скорости выделения кислорода (А02 ) на ДК-свету в присутствии «сопровождающего» света — в данном случае бли­ жнего красного света (БК-света) — к выделению Ог на ДК-свету

в эффекте усиления. Было показано также, что спектр эффекта

Описанные наблюдения привели Эмерсона к чрезвычайно важному выводу об участии в фотосинтезе двух фотореакций: сенсибилизируемой Хл а и сенсибилизируемой дополнительными

пигментами. Однако результаты дальнейших исследований при­ вели к постановке следующего вопроса: действительно ли одна из фотореакций вызывается дополнительным пигментом? Вопервых, возбуждение дополнительного пигмента вызывает сен­ сибилизацию флуоресценции именно Хл а, что доказывает пере­ нос энергии на Хл а от дополнительного пигмента. Во-вторых,

Рис. 8. Распределение различных форм хлорофилла внут­ ри двух фотосистем (по Рабиновичу и Говинджн [814]).

F— флуоресценция. Пояснение в тексте.

Говинджи и Рабинович обнаружили (на хлорелле) в 1960 г. кро­ ме пика за счет возбуждения дополнительного пигмента эффект усиления внутри главной полосы поглощения самого Хл а. Это изменило картину: было сделано заключение, что один квант поглощается одной формой Хл а, а другой квант — либо допол­ нительным пигментом, либо другой формой того же Хл а! Таким образом, можно допустить, что дополнительный пигмент пере­ дает поглощенный квант этой другой форме Хл а. Однако для красных водорослей заключение Эмерсона относительно эффек­ та усиления, по-видимому, остается в силе [814].

Рабинович и Говинджи [814] интерпретируют отношение пиг­ ментов к двум фотосистемам следующим образом (рис. 8). Обе фотосистемы содержат Хл Ь, но в фотосистеме I I (ФС-П) его больше, чем в фотосистеме І (ФС-І). ФС-И отличается относи­ тельно сильной флуоресценцией, содержит Хл а670 и Хл а680 и

не содержит Хл а695. В ФС-І примерно столько же формы Хл Й670 и довольно много — до 10% всего Хл а — в виде формы Хл а695.

В опытах на хлорелле в конце 50-х гг. были обоснованы пред­ ставления о двух взаимозависимых реакциях фотосинтеза, ини­

реллы точка раздела между реакциями по шкале длин волн ле­ жит при 680 нм. Эффект падения квантового выхода фотосинте­ за при действии света с длиной волны, превышающей 680 нм, хорошо укладывается в такое объяснение, так как добавление более коротковолнового света восстанавливает квантовый выход.

Методы раздельного определения спектров действия для двух фотосистем у хлореллы были разработаны в 1960 г. Френчем и Дюйсенсом. Измеряя эффект действия света разных длин волн на фоне действия достаточно сильного (хотя и ненасыщаю­ щего) света, эффективного для одной из фотосистем, определяют спектр действия для д р у г о й фотосистемы. Иначе говоря, когда избыток света идет на инициирование реакции ФС-І, до­ бавляя свет разных длин волн, определяют спектр действия ФС-Н, и наоборот. Взаимоотношение двух фотосистем при дей­ ствии соответствующих лучей определенной длины волны, воз­ буждающих каждую из них, оказывается более сложным, чем это могло бы показаться на первый взгляд, и вот почему.

1. При действии ДК-света наблюдается падение квантового выхода, но не полное прекращение фотосинтеза.

2. Допустив, что две системы пигментов осуществляют раз­ ные фотореакции, причем эти фотореакции протекают последо­ вательно и одна из них является следствием другой, следует допустить и то, что инициирующий каждую фотореакцию «свой» свет должен быть каким-то образом распределен между двумя фотосистемами. Если луч света с определенной длиной волны не может быть актиничным для обеих фотосистем, то можно ожи­ дать, с одной стороны, полного прекращения фотосинтеза, а с другой — протекания некоторых реакций, характерных только для одной фотосистемы.

Реакцией на известную неопределенность соответствующих опытов явились гипотезы о наличии уже не двух, а трех фото­

тавляемой двумя лучами света разных длин волн, находит от­ ражение в развитии двух гипотез, выдвинутых около 10 лет назад.

Согласно г и п о т е з е « п е р е л и в а н и я » з а р я д а Дюйсенса и Амеза [354], весь избыток того света, который должен быть

поглощен ФС-П, т. е. более коротковолновый свет, может быть «перехвачен» длинноволновой системой (ФС-І): квант более ко­ ротковолнового света в результате многократных резонансных переносов между пигментами с частичной потерей в форме безызлучательной энергии в конечном итоге улавливается ловуш­ кой ФС-І.

По г и п о т е з е р а з д е л ь н о й у п а к о в к и , уравновеши­ вание достигается с помощью одних и тех же пигментов-«ан- тенн», даже если их отношения в фотосистемах будут резко от­ личаться. Однако каждая фотореакция связана со «своими» мо­ лекулами-антеннами, и фотосистемы не способны передавать одна другой захваченные фотоны. Эта гипотеза выдвинута Май-

В заключение отметим, что «эффекты усиления» обнаружи­ ваются при действии лучей разнокачественного света даже с ин­ тервалами до нескольких секунд.

4. ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ ХЛОРОФИЛЛА

Фотоны флуоресценции хлорофилла in vivo происходят из молекул «хлорофильной матрицы» ФЕ [132] и испускаются по­ следней до рассеивания или акта локализации возбуждения в «открытом» реакционном центре, где происходит быстрая конверсия энергии электронного возбуждения в химическую •форму энергии восстановленного первичного акцептора. Следо­ вательно, «открытый» реакционный центр играет роль центра •тушения флуоресценции. Конверсия энергии возбуждения в «закрытом» фотохимическом центре невозможна; центр переста­ ет играть роль ловушки, и миграция энергии продолжается.

Хл a in vivo флуоресцирует практически так же, как в раст­ ворах in vitro, и поэтому изучение флуоресценции очень удобно для незамедлительного получения важных характеристик со­ стояния и работы фотохимического аппарата.

При изучении флуоресценции нет необходимости прибегать к какому-либо химическому или физическому повреждающему воздействию. Это становится понятным, если рассмотреть прин­ цип работы прибора для изучения флуоресценции — спектрофлуориметра [105, 671, 637]. Спектрофлуориметр состоит из мо­ нохроматора возбуждающего света, кюветы для образца, мо­ нохроматора измеряемого света, конструктивно связанного с измерителем, и усилителя фототока. Между монохроматором из­ меряемого света и кюветой находятся фильтры, задерживающие возбуждающий свет. Приборы для измерения флуоресценции

хлорофилла при низких температурах имеют дополнительные приспособления в кюветной камере.

Выше указывалось, что при действии на хлорофиллсодержащие ткани высших растений или суспензию клеток хлореллы света, поглощаемого дополнительными пигментами, происходит тем не менее возбуждение флуоресценции с максимумом (при комнатной температуре) около 684—685 нм, характерным для флуоресценции Хл а. Перенос энергии от Хл b к Хл а происхо­ дит столь быстро, что наблюдать флуоресценцию Хл Ь не удае­ тся. Феномен возбуждения флуоресценции Хл а при погло­ щении света дополнительными пигментами хорошо изучен на растворах. Различные дополнительные пигменты по-разному вызывают флуоресценцию Хл а.

Оказалось также, что кривая флуоресценции приблизитель­ но соответствует кривой спектра действия фотосинтеза. Рабино­ вич с соавт. [814] определяют выход флуоресценции Хл а (отно­

in vitro. Вероятно, эти значения относятся к форме Хл а673, так как при комнатной температуре флуоресцирует именно эта фор­ ма. Как и в растворах, выход флуоресценции Хл a in vivo уве­ личивается с повышением интенсивности освещения до некото­ рого предела, а затем остается постоянным.

Исследуя пространственное расположение молекул хлорофил­ ла в ФЕ, применяют освещение плоскополяризованным светом. При комнатной температуре степень поляризации флуоресцен­ ции оказывается очень низкой: по-видимому, перенос энергии происходит между различно ориентированными молекулами.

Разведенная суспензия фрагментов хлоропластов при ком­

тогда как для Хл а683 он составил бы всего 1 нм, что, учитывая сдвиг Стокса и величины, полученные для Хл а в органических

которую приписывают форме Хл об83 [424, 625]. В лаборатории

для хлоропластов шпината. По-видимому, положение полос и интенсивность флуоресценции сильно зависят от того, насколько точно выдерживается температура во время опытов.

Форма хлорофилла П700 не флуоресцирует даже при темпе­ ратуре жидкого азота [425]. Изучение флуоресценции не только

в 1960 г. наблюдал, что флуоресценция Хл а у хлореллы, воз­ буждаемая красным или синим светом, становится слабее, если одновременно суспензии клеток хлореллы начинают освещать ДК-светом. Батлер [277] показал, что предварительное осве­ щение светом, который преимущественно поглощается ФС-П, усиливает флуоресценцию, тогда как предварительное освещение ДК-светом, поглощаемым преимущественно ФС-І, снижает флуо­ ресценцию. Затем Дюйсенс и Свирс [356] обнаружили, что до­

результате освещения хлоропластов при комнатной температуре возрастает почти исключительно за счет ФС-П. После предвари­ тельного периода темноты или же освещения хлоропластов ДК-

сенс и Свирс пришли к заключению, что выход флуоресценции зависит от редокс-состояния гипотетического «тушителя» флуо­

Вообще говоря, систему электронного транспорта не следует представлять в виде ряда параллельных непрерывных цепей пе­ реносчиков, каждая из которых связывает определенный реак­ ционный центр ФС-П с определенным реакционным центром ФС-І. По-видимому, имеется пул (обобществленный резервуар) промежуточных переносчиков на восстановительной стороне ФС-П, которые восстанавливаются, получая электроны от мно­ гих ЭТЦ. Низкий выход флуоресценции соответствует окислен­ ному состоянию Q, аналогично действию химических окислите­

реакции Хилла (см. в части I I I ) . Феррицианид может реагиро­ вать в одних случаях через посредство ФС-П, а в других — ФС-І.

Следовательно, флуоресценция отражает ход восстановления первичного окислителя ФС-П Q и конечный уровень Fco зависит от скорости освобождения электронов из ФС-П на электроноакцепторный пул, а также от скорости обратного окисления ФС-І. Б конечном итоге ФС-І является окислителем ФС-П [627]. При наличии в пробе с хлоропластами избыточного количества окис­ лителей типа феррицианида выход флуоресценции остается низ­ ким — на уровне F 0 .

В интактных клетках растений наблюдаются два типа изме­ нений флуоресценции Хл а [356, 744], инициируемых светом. Один тип объясняется отсутствием тушения флуоресценции при разобщении (разделении сопряженных механизмов- с помощью ядов или других воздействий) ФС-П и ФС-І. Другой тип флуо­ ресценции зависит от какого-то непонятного механизма тушения.

Клейтон [311] показал, что уровень флуоресценции в обыч­ ных условиях лишь в некоторой мере зависит от той части Хл а, которая относится к ФС-П. Выяснилось, что с прекращением работы реакционного центра ФС-П выход флуоресценции воз­ растал в пять раз, причем хлорофилл, не связанный с реакцион­ ными центрами, характеризовался стабильным выходом флуо­ ресценции. (Результаты Клейтона относились к «нормальной», а не «замедленной» фазе флуоресценции.)

Уровень флуоресценции варьирует в зависимости от коли­ чества хлоропластов в пробе и силы света. В слабом актиничном свете флуоресценция остается низкой, на уровне F0 -

Еще в 1951 г. Штрелер и Арнольд обнаружили слабую фо­ толюминесценцию у фотосинтезирующих объектов [889].

Мы рассмотрели, таким образом, самые общие закономернос­ ти флуоресценции. Данные по флуоресценции будут широко ис­ пользованы нами при обсуждении вопросов переноса электрона и описании результатов исследований в области анализа и ре­ конструкции ЭТЦ.

5.ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ПИГМЕНТЫ

Вэтом параграфе кратко рассматриваются данные, касаю­ щиеся хлорофилла, каротина и каротиноидов и некоторых пиг­ ментов, роль которых до настоящего времени представляется неясной.

П700. Длинноволновая форма Хл а с максимумом в области 700 нм, открытая Коком [624], является конечным пунктом пе­ реноса поглощенных фотонов- и передачи энергии в ФС-І. На­ звание дано по характерному максимуму поглощения окисленно­ го пигмента в красной области спектра. Поглощение при 700 нм уменьшается после восстановления.