книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

уравновешивает энергетически образование интермедиата. Такое

потенциала в хлоропластах при освещении могут быть абсорб­

в присутствии ФМС как при постоянном освещении, так и при импульсах света различной продолжительности. Обнаружено, что разобщители— КЦФГ и нигерицин — в присутствии солей калия способствуют уменьшению амплитуды изменений поглощения при 515 нм и тормозят образование АТФ. Оказалось, что в оп­ ределенных условиях скорость уменьшения амплитуды изменений

[759] измерение изменений поглощения при 515 нм как индика­ тора изменений АЕ (мембранного потенциала) оспаривается, хо­ тя авторы не предлагают взамен более убедительного показателя.

В последние годы вырисовывается возможность применения некоторых проникающих аьионов (зондов) в качестве метода обнаружения мембранного потенциала, например, 1-анилин-8- нафталинсульфоната, обладающего свойством изменять флуо­ ресценцию в ответ на изменения в «энергизации». С помощью этого метода — флуоресцентного зонда — при изучении мито­ хондрий животных клеток Чансу [289], в частности, удалось по­ казать, что энергозависимый участок мембраны локализован в водной поверхности раздела между наружным слоем белков (ви­ димо, цитохромов) и мембранным барьером. Водная фаза пред­ ставляет участок структурированной воды, и «энергизация» мембраны, возникающая вследствие изменения редокс-потенциа­ ла цитохрома, локально влияет и на трансмембранное распреде­ ление заряда и последующие передвижения различных ионов.

Применение зондов для исследования изменений мембранного потенциала в хлоропластах позволит, по-видимому, получить ощутимые результаты уже в ближайшем будущем.

Линн [686] использовал описанную Чансом и Мела в 1966

и 1967 гг. другую методику, основанную на способности некото­ рых красителей-индикаторов связываться с поверхностью мем­

Линн подтвердил эти результаты на хлоропластах, но обра­ тил внимание на то, что высокая внутренняя концентрация про­ тонов необходима для поддержания ЭТЦ в восстановленном со­ стоянии [685]. Те высокопотенциальные акцепторы электронов, которые окисляют ЭТЦ (например, хинон или феррицианид), даже при быстром переносе электронов ингибируют как накопле­ ние протонов внутри тилакоидных мешочков, так и фосфорилирование.

Применив спектрофотометрический метод наблюдения за из­ менениями индикатора нейтрального красного, который протонировался при освещении хлоропластов при величинах рН выше рКа, а восстанавливался при рН нижер/(а , Линн пришел к заклю­ чению, что для фосфорилирования необходимо наличие, наряду с протоном, еще и электрона внутри тилакоида, т. е. необходимы восстановительные условия. Если условия среды были окисли­ тельными, а не восстановительными, то при постоянной скоро­ сти тока электронов никакого поглощения протонов не проис­ ходило.

АТФ происходит при кислотно-щелочных переходах или при наличии градиента рН, причем оно не сопровождалось транс­ портом электрона. Линн же доказывал [686], что скорость ФФ линейно пропорциональна по отношению к уровням восстанови­ тельного потенциала и концентрации протонов внутри хлоропла­ стов, причем фосфорилирование является следствием окисления некоторых неизвестных протонированных переносчиков. То, что скорость фосфорилирования прямо пропорциональна скорости окислительного электронного транспорта, вытекало из наблюдае­ мого Линном параллельного уменьшения скорости как фосфори­ лирования [685], так и окислительного электронного потока [686] после периода освещения. Поэтому фосфорилирование должно зависеть от концентрации каких-то неизвестных прото­ нированных переносчиков электрона, окисление которых и при­ водит к фосфорилированию.

Поглощение протонов является восстановительным процессом, а также следствием улавливания электронов внутри хлоропла­ стов. В 1969 г. Линн и Штрауб [688] описали выделение

(с использованием стадии экстракции раствором ЭДТА) раст­

а методика его выделения в принципе не отличалась от опи­ санной выше методики выделения СФ! Вамбутаса и Рэкера [932].

Однако вывод Линна о том, что фосфорилирование, вызывае­ мое разницей в концентрации протонов, является в действитель­ ности результатом переноса электрона неиндентифицированным до настоящего времени переносчиком, серьезно оспаривается Майлсом и Ягендорфом [724]. Путем применения ингибиторов ЭТЦ этим авторам удалось в сильной степени затормозить транспорт электронов без нарушения фосфорилирования. Тем не менее Линн [686], считая доказанным, что фосфорилирование зависит как от восстановительного потенциала, так и от потен­ циала протонов внутри хлоропластов (никакого поглощения про­ тонов не происходило, если условия среды были окислительны­ ми), пришел к заключению, что фосфорилирование является следствием окисления некоторых протоннрованных электронных переносчиков.

Передвижение ионов нейтральных органических молекул и воды в хлоропласты и через мембраны приводит еще к одному важному эффекту, выражающемуся в изменении объемов хлоро­ пластов.

Изменение объема хлоропластов при освещении было впервые доказано Пакером в 1962 г. [786], причем позднее было обнару­ жено, что такие изменения происходят в биологически активных хлоропластах и отражают протекающие физиологические про­ цессы.

Пакер и Крофтс [788] приводят следующие объяснения инду­ цируемого светом изменения объема хлоропластов. Например, известно, что изменения светорассеяния, обусловленные сокраще­ ниями хлоропластов, наблюдаются в присутствии слабых кислот. В темноте ацетат (или другие анионы) находятся в хлоро­ пласте и вне его в равных концентрациях. При освещении соз­ дается протонный градиент; протоны транспортируются в хлоро­ пласты, обмениваясь на внутренние катионы; происходит сдвиг равновесия внутри хлоропласта в сторону образования недиссоциированных форм слабых кислот. В результате возникает кон­ центрационный градиент, направленный наружу; недиссоциированные формы кислот выделяются из хлоропластов, что приво­ дит к созданию внутри хлоропластов гипотонических условий. Это вызывает вытеснение наружу воды, компенсирующее давле­ ние, и в результате — уменьшение объема, занимаемого хлоро­ пластами.

Для измерения изменений объемов хлоропластов использо­ ваны методы прямых измерений размеров частиц [870], непря­ мое измерение изменений относительных размеров и оптических

характеристик и электронномикроскопическое изучение. Было показано [788], что изменения в поглощении более точно отра­ жают конформационные изменения, чем изменения в светорас­ сеянии при 90° [335]. Однако между описанными контролируе­ мыми параметрами, которые отражают изменения «конформационного» состояния хлоропластов при действии одного и того же индуктора, обнаруживаются значительные расхождения, которые могут быть обусловлены тем, что с помощью различных методов определяются изменения, происходящие на разных уровнях организации хлоропластов.

То, что уменьшение объемов хлоропластов или увеличение светорассеяния отражает функционирование ЭТЦ в хлоропла­ стах, по мнению Гуда, Изава и Хайнда [430], доказывается сле­ дующим:

— ингибиторы реакции Хилла подавляют изменения:

— изменения усиливаются при внесении акцепторов электро­ нов или редокс-кофакторов;

—• АТФ вызывает уменьшение объемов хлоропластов в тем­

ноте;

— «стареющие» хлоропласты восстанавливают свою способ­ ность к уменьшению объемов на свету при добавлении АТФ;

— гидролиз АТФ на свету (проявление активности АТФ-азы, зависящей от магния и сульфгидрильных активаторов) связан

суменьшением объемов хлоропластов;

—процессы светорассеяния (в отсутствие разобщителей) и процессы накопления энергии для последующего темнового фос­ форилирования (двухстадийное ФФ) имеют одни и те же оптимумы рН (5—6);

—при таких же условиях наблюдается частичное торможе­

ние уменьшения объемов во время фосфорилирования, т. е. когда добавляют АДФ и Фн ;

— транспорт электронов при разобщении некоторыми инги­ биторами оказывает в конечном итоге эффект на конформацион­ ные изменения.

Юнг с соавт. из лаборатории Грина [1030] не отрицают роли мембранного потенциала как силы, вызывающей перемещения ионов. Но, по их мнению, электронный транспорт вызывает прежде всего изменения в конформации белковых молекул, что в свою очередь вызывает генерирование асимметричного заряда мембран. Затем следует перемещение способных к проникнове­ нию через мембраны ионов в соответствии с направленностью градиента химического потенциала. «Конформационная модель активного транспорта», выдвинутая этими авторами в 1970 г., выражает последовательность событий для дыхательной цепи (митохондрий) в виде следующей схемы:

потенциала ->• 5) Изменение распределения ионов -> 6") Изменение ос­ мотического давления 7) Перераспределение молекул воды.

Авторы подчеркивали, что все перечисленные события.проте­ кают одновременно и до тех пор, пока не достигнуто состояние равновесия. Основу конформационных изменений составляют изменения в соединении молекул белка и анионов слабых кислот, тогда как наличие катионной помпы в митохондриях отрицается. Последнее обстоятельство оказывается очень важным, так как градиент ионов отражает наличие мембранного потенциала.

Самые различные факторы влияют на конформацию молекул белков, которые входят в состав биологически активных мемб­ ран, и наши сведения о них еще явно недостаточны. Например, проводятся исследования по изучению влияния различных кон­ формационных изменений на функционирование отдельных изо­ лированных биологически важных белков. Один из них — Цит с.

Получены доказательства конформационных изменений Цит с, влекущих за собой разрушение гидрофобных, водородных и ионных связей в случае изменения ионной силы в растворе, в частности при действии органических растворителей [578, 579]. Превращения окисленной и восстановленной форм Цит с обна­ руживают заметные различия. Ферроцитохром с более устойчив против индуцированных температурой конформационных измене­ ний, чем феррицитохром с [279]. Последний обнаруживает на 10% меньший водород-дейтериевый обмен [927], а также менее устойчив к протеолитическому перевариванию [777]. На примере Цит с доказано, что конформационные изменения структуры мо­ лекул приводят к изменениям окислительно-восстановительных свойств. Доказано, в частности, что восстановление Цит с аскорбатом зависит от конформационного состояния молекул [874]- Изменение положения пика поглощения Цит с в области полосы Соре отражает конформационные изменения этого протеида [579], которые в принципе могут быть источником энергии.

Молотковский [90] замечает, что термин «конформация мем­ бран» в последнее время приобрел слишком широкое употребле­ ние, и это, в известной мере, привело к его обесцениванию. Как конформационные рассматриваются любые изменения структуры, в том числе такие, которые являются следствием не вполне по­ нятных процессов и не связаны с изменениями в мембранах на молекулярном уровне. Поэтому под конформационными измене­ ниями мембраны следовало бы понимать кооперативные измене­ ния трехмерной геометрии субъединиц по всей мембране, пря­ мым следствием которых является изменение ультраструктуры.

Итак, последние данные, полученные в разных лабораториях мира, хотя и приводят к установлению определенной взаимо­ зависимости между феноменами переносов протонов и других катионов, образованием электрического поля через мембрану тилакоида, изменениями при 515 нм и конформационными пре­ вращениями, в частности, с изменениями объемов хлоропластов,

поглощением ионов хлоропластами и другими явлениями,— еще не в состоянии раскрыть сущность процесса фосфорилирования в хлоропластах. Вырисовываются два главных направления в объяснении механизмов образования АТФ: при осуществлении транспорта электронов первичные изменения связываются с обра­ зованием трансмембранного потенциала или, в качестве альтер­ нативы, с конформационными изменениями.

В связи с этим возникает вопрос: а как же быть с химиче­ ской гипотезой сопряжения? Можно ли считать, что она утратила свое значение и ее следует сдать в архив? Как оказалось, в по­ следние годы на простых модельных системах получены важ­ ные результаты, которые в значительной степени служат под­ держкой химической концепции сопряжения. К таким модельным системам в первую очередь относятся искусственные модельные системы генерирования АТФ.

4. ПРОСТЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ГЕНЕРИРОВАНИЯ АТФ

Непременным условием образования АТФ в соответствии с хемиосмотической теорией является наличие мембраны с ани­ зотропными свойствами, причем эта мембрана должна быть полупроницаемой для ряда нейтральных молекул или ионов. Однако в последние годы открыты химические пути генерирова­ ния АТФ, которые могут произвести настоящий переворот в име­ ющихся представлениях о путях синтеза этого важнейшего для существования жизни вещества.

Замечательным нам кажется также факт зависимости обра­ зования макроэргической фосфатной связи от наличия в системе именно Цит с.

В лаборатории А. А. Красновского в начале 50-х гг. была продемонстрирована возможность фогоредукцни Цит с в мо­

В модельной системе находились агрегированный хлорофиллид а (в качестве фотосенсибилизатора), Цит с, НАДФ+, Фп (выполнял функцию цитохром-НАДФ-редуктазы). Величина рН 7 поддерживалась фосфатным буфером. Условия были строго анаэробные.

Ту и Уанг считали, что непосредственную роль в системе играли образованные под действием света четыре формы хлорофиллида а: в основном и возбужденном состоянии и в виде

окисленного и восстановленного радикалов. Эти формы вовлека­ ли в окислительно-восстановительные превращения Цит с и Фп, тогда как реакция восстановленного Фп и окисленного НАДФ была вторичной. В отсутствие как Фп, так и Цит с система не была способна восстановить НАДФ. В полной системе свет со­ вершает работу против градиента химического потенциала в ко­ нечном итоге на 0,36 в, а квантовый выход составляет 5,3%.

В 1970 г. Хантер, Пайнтер и Фреде опубликовали серию ста­ тей, в которых показано, что в присутствии того же Цит с происходит образование АТФ за счет окисления восстановленно­ го глутатиона (Г-SH) в грис-буфере [402, 792, 793].

Остановимся на этих работах несколько подробнее. В «чи­ стом» растворе, т. е. в отсутствие митохондрий, хлоропластов или факторов, выделенных из них, восстановление Цит с осуще­ ствляется двумя реакциями. Одна, катализируемая металлами, сильно ингибируется при повышении ионной силы до физиоло­ гических значений. Другая, катализируемая окисленной формой глутатиона или другими дисульфидами, к изменениям ионной силы нечувствительна, возможна лишь в анаэробных условиях.

Пайнтер и Хантер [792, 793] изучили окисление восстановлен­ ной формы глутатиона Цит с, катализируемое десятикратным избыточным количеством окисленной формы глутатиона, и по­ казали образование АДФ или АТФ за счет АМФ и Ф и или соответственно АДФ и Фп . Образование АТФ происходило в

кое фосфорилирование разобщалось Ю - 5 М 2,4-ДНФ и дикума-

Продолжительность реакции окисления, сопряженной с фосфорилированием, составляла одну-две минуты, но при добавле­

и система напоминала АТФ-азу. АТФ, образованный в модели, также гидролизовался после внесения разобщителя ОФ. Дей­ ствие разобщителей по отношению к данной модельной системе весьма напоминает их действие на «истинное» ОФ.

ЭДТА, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 24 мкМ Цит с, 1мМ Г-SH и 10 мМ T-SS-Г. Концентрация кофакторов фосфори­ лирования составляла для Ф н 1 мМ или для АДФ 0,4 мМ. За хо­ дом реакций следили по изменению оптической плотности при 340 нм в специальных анаэробных 10-миллиметровых кюветах спектрофотометра Цейса. Реакции проводили при 25°. Изме-

аденилаткиназы или АДФ), а также Цит с приводило, как пра­ вило, к отсутствию заметных изменений оптической плотности, однако в специальных опытах было доказано, что изменение ве­ личины оптической плотности при 340 нм обусловлено образова­ нием НАДФ-Н, а не образованием, например, свободных ра­ дикалов, поглощающих в этой области спектра. Были также приведены доказательства отсутствия НАДФ-Н-окисляющих факторов, таких как r-SS-Г-редуктазы. Хотя изучение превра­ щений фосфорных соединений с помощью Р 3 2 могло бы оказаться полезным, Пайнтер и Хантер в описываемой серии исследований меченых соединений не применили.

Стабильность интермедиатов, которую определяли по сохра­ нению способности реакционной системы образовывать АТФ при добавлении компонентов с промежутками во времени, измеряе­ тся десятками минут, но в присутствии АДФ без Ф н составляет менее 10 мин. В присутствии О2 интермедиа™ не стабильны.

r-ss-r -»» T-SS-Г T-SS-Г -»- Г-SS-r-f r-s+.

ГГ f

Согласно гипотезе, образуемая надмолекула не только облег­ чает прохождение стадий переноса электрона и стабилизирует первый (Г-S- —э-Г-S-) и второй (Г-S-—•* T-S+) продукты окис­ ления, но и может быть вовлечена в реакции, связанные с сохра­ нением энергии, образуя в конечном итоге АТФ.

Пайнтер и Хантер [793], разбирая возможные механизмы фосфорилирования в описываемой системе и подчеркивая клю­ чевые позиции глутатиона в этом акте, указывают на особо важ­ ную роль ионов сульфония. Так как перенос электрона является двухстадийным процессом, ион сульфония в виде надмолекулы последовательно дважды отдает по одному электрону двум мо­ лекулам Цит с. Учитывая стехиометрические отношения в виде одного акта фосфорилирования на одну молекулу Цит с, эти акты следует связать с актами «утраты» электрона комплексами серы. Кроме того, допускается фосфорилирование на одной из двух стадий переносов электрона. Действие разобщителей или кислорода также может проявляться в двух пунктах отдачи

электрона надмолекулой глутатиона. Кислород легко окисляет как Г-S-, так и T-S+.

Относительно образования макроэргической связи фосфата в виде формы T-S+ в литературе накоплены определенные све­ дения. Ион фосфата должен вступать в комплекс переноса за­ ряда со стабилизированным ионом сульфоння. В результате образуется значительно более стабильный интермедиат, активи­ руемый нуклеофильной атакой со стороны молекулы АДФ с пе­ реносом заряда. Притяжение электрона серой сульфония обра­ зует АТФ. Одновременно образуется Г-S—ОН — первоначально, быть может, внутри кольца атомов серы с радикалом F-SS-Г, немедленно акцептирующим электрон. Ход процесса представлен на следующей схеме из работы Пайнтера и Хантера [793]:

Цитохром і

Реакционные механизмы, участвующие в описанной Пайнтером и Хантером системе, по их мнению, следует рассматривать как возможный аналог формы сохранения энергии при митохондриальном ОФ. Тиоловые и дисульфидные группы в модели, представленные Г-SH и Г - SST в митохондриях, могут быть выражены серусодержащими железо-негеминовыми белками.

Вероятно, описанные открытия служат в определенной мере поддержкой рассмотренной кратко механохимической теории Бойера: in vivo образование комплексов тиоловых и дисульфидных групп возможно в результате конформационных превраще­ ний внутри одной молекулы белка или нескольких молекул, содержащих эти группы. И все же, очевидно, еще рано делать определенные выводы об идентичности процессов, описываемых

при этом образуются комплекс Fe3+-reMa и реакционный ради­ кал имидазола (C3H3N2). Затем имидазольный радикал быстро реагирует с Фн , образуя нестабильный фосфоимидазольный ра­ дикал, в последующем восстанавливаемый другой молекулой ферроцитохрома с с образованием 1-фосфоимидазола и воды:

Образование тригонального бипирамидального интермедиатного соединения 1-ортофосфатимидазола C3H5N2P4O42 - посред­ ством обычной нуклеофильной атаки на атом фосфора является не только очень медленным, но и термодинамически невыгодным. Однако, так как реакция с радикалами обычно нуждается в значительно более низкой свободной энергии активации, радикал СзНбМ2 Р04~ может быть образован существенно быстрее посред­ ством присоединения радикала по месту двойной связи Р = 0. На последующей ступени, осуществляемой за счет свободной, запасенной в химических потенциалах энергии, этот фосфоимид­

В статье Ту и Уанга [926] показано, что тот же молекулярный механизм может участвовать в сопряжении инициируемого све­ том электронного транспорта в отсутствие 0 2 . При анализе спектров ЭПР замороженных образцов было установлено, что имидазольные радикалы, получаемые при переносе электронов, быстро образуют связи P ~ N с Ф ш после чего эти связи после­ довательно восстанавливаются в макроэргические связи 1-фос­ фоимидазола в водном растворе с нейтральным рН