книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

Определенным развитием механохимичёских идей Байера можно считать выдвинутую в 1969 г. Вейсом [972] гипотезу превращения энергии при окислительном фосфорилнровании в результате процессов попеременного растяжения i-i сокращения в мембранах. Конформационные изменения определяются нали­ чием фосфолипопротеидов и некоторых других молекул, вхо­ дящих в двуслойную структуру мембран, причем свойство эла­ стичности мембран делает возможным существование пунктов, обладающих переменной адсорбцией. Образование АТФ может иметь место в результате функционирования механизмов ионного обмена.

Фосфолипопротеиды или родственные вещества, входящие в структуру мембран, образуют локальные пункты ионного обмена, в которых находятся негидратированные катионы калия, если мембрана в состоянии сокращения, и гидратированные катионы натрия, если мембрана в состоянии растяжения. При сокра­ щении происходит реакция с вовлечением карбонильной группы одного полимерного сегмента и тиоспиртовой группы второго такого сегмента. В результате образуются тиоэфирные мостики между сегментами (состояние сокращения).

В ходе реакции тиокарбоксилирования образуется сложный комплекс (структура его, по Вейсу, гипотетична) и освобожда­ ется гидроксил, который в составе гипотетичного соединения ре­ агирует с протоном, магнием и АДФ и в присутствии ферментов фосфорилирования освобождает АТФ. Все частные реакции обратимы. Связь данных реакций с процессом фотосинтеза не рассматривается.

Как и авторы обсуждавшихся ранее гипотез, Вейс распола­ гает только косвенными данными в пользу развиваемых им пред­ ставлений, а предлагаемые им уравнения [972] носят достаточно умозрительный характер.

Рассмотренные гипотезы отнюдь не исчерпывают всех воз­ можных подходов относительно механизмов запасания энергии при фотосинтезе и дыхании; сам факт сосуществования довольно противоречивых представлений свидетельствует о неполноте наших знаний. Читателю будет предоставлена возможность вы­ бора между этими гипотезами после более подробного ознаком­ ления с экспериментальными данными.

2. РАЗДЕЛЕНИЕ А П П А Р А Т А ФОТОФОСФОРИЛИРОВАНИЯ НА КОМПОНЕНТЫ. СОПРЯГАЮЩИЕ ФАКТОРЫ

Важной особенностью тилакоидных мембран является стро­ гая структурная упорядоченность составляющих их функцио­ нальных субъединиц. Логичны попытки выделить такие субъ­ единицы, изучить их свойства и попытаться вновь восстановить всю систему, природа связей между компонентами которой еще

недостаточно ясна. Выше рассматривались методические приемы, позволяющие выделять пигмент-белковые комплексы из хлоро­ пластов. Разделение хлоропластов, точнее тилакоидов, в которых протекает ФФ, на мультиэнзимные комплексы, сохраняющие способность к реконструкции всего процесса, представляет за­ дачу иного плана.

Синтез АТФ хлоропластами на свету сопряжен с окислитель­ но-восстановительными реакциями переноса электронов. Компо­ ненты, которые могут быть выделены из хлоропластов (или соответствующие компоненты из митохондрий) и стимулируют фосфорилированне, не влияя на скорость переноса электронов, названы «сопрягающими факторами» (СФ).

Ягендорф в 1962 г. открыл [547], что после экстракции хлоро­ пластов раствором ЭДТА уровень ФФ с такими хлоропластами резко падает, причем эффект зависит именно от присутствия в среде ЭДТА. Концентрацию ЭДТА необходимо было поддержи­ вать на уровне около Ю - 3 М. Однако активность ФФ сохранялась, если в среде одновременно с ЭДТА находились катионы: двух­ валентные в концентрации не менее 10~4 М, а одновалентные — Ю - 2 М. Позднее Аврон обнаружил, что ФФ частично восстанав­ ливалось при добавлении к обработанным хлоропластам экстрак­ та ЭДТА вместе с солями магния [194].

Эти открытия имели отношение к АТФ-азе хлоропластов. Хотя по первым результатам [178, 205] казалось, что активность АТФ-азы в хлоропластах очень низкая, в дальнейшем было по­ казано, что это не так. В разных лабораториях было установ­ лено, что АТФ-аза хлоропластов нуждается в активации, после чего ее активность становится достаточно высокой.

АТФ-азная активность стимулируется ионами кальция или магния. Вамбутас и Рэкер [932] в 1965 г. показали, что АТФ-аза находится в латентной форме (после выделения в раствор из хлоропластов) и для ее активации необходима кратковремен­ ная инкубация с трипсином. В раствор переходят две АТФ-азы: одна зависит от кальция, другая — от магния. В развитие работы Аврона [195], открывшего сопрягающий фактор при ФФ, была обнаружена замечательная способность препарата Са-активи- руемой АТФ-азы служить таким сопрягающим фактором об­ разования АТФ для экстрагированных субхлоропластных частиц.

Рассмотрим некоторые методические приемы выделения и определения активностей ферментов, участвующих в реакциях фосфорилирования. Испытания активности АТФ-аз проводили в присутствии АТФ, трис-буфера рН 8,0, фосфоенолпирувата и пируваткиназы. В реакционные смеси вносили соли кальция или магния (для определения соответствующих АТФ-аз), а о ходе реакции судили по количеству освобождающегося фосфора. Зависимую от кальция АТФ-азу активировали трипсином в те­ чение нескольких минут, затем действие трипсина останавливали

внесением в реакционные смеси ингибитора трипсина, который выделяли из бобов сои. Только после этого можно было опре­ делять активность Са-активируемой АТФ-азы. В противном случае уровень активности был очень низким.

Испытание сопрягающей активности проводили с частицами хлоропластов, подвергнутыми специальной обработке. В опытах использовали субхлоропластные частицы, полученные озвучива­

среде, с последующим выделением фракции частиц, осаждав­

натрия), то уровень ФФ был достаточно высок и без добавления СФ . Отметим также, что частицы, выделенные в бессолевой среде, отличались под электронным микроскопом от частиц, выделенных в присутствии солей.

Для определения сопрягающей активности в реакционные сосудики вносили латентную зависимую от Са АТФ-азу, субхло­ ропластные частицы, субстраты и кофакторы ФФ и затем опре­ деляли ход ФФ [924].

Несколько позднее Моудрианакис с соавт. [737], проведя электронномикроскопическое изучение, показали, что при отмыв­ ке 1 мМ раствором ЭДТА мембраны хлоропластов теряют с поверхности частицы, которые Парк с соавт. приняли ранее ошибочно за квантосомы. Однако оказалось, что после отмывки мембраны сохраняют высокую активность реакции Хилла, но не реакций, относящихся к ФФ, например реакции обмена АТФ — АДФ.

Вернемся к описанию биохимических свойств таких частиц. Неочищенный супернатант, полученный после осаждения субхлоропластных частиц по методике выделения в бессолевой сре­ де, в значительной степени восстанавливает высокую скорость ФФ [737].

Вамбутас и Рэкер описали очистку латентной АТФ-азы, ко­ торая в роли СФ оказалась даже более эффективной, чем су­ пернатант. Максимальное ФФ было достигнуто с 30 мкг белка, пропись выделения которого приведена ниже. Более высокие кон­ центрации ингибировали ФФ. Интересно, что препараты активи­ руемой магнием АТФ-азы хлоропластов не могли заменить этот фермент в качестве СФ. В роли СФ латентная Са-активируемая АТФ-аза при испытании до инкубации с трипсином оказалась неактивной, но становилась активной после обработки трипсином и его последующего выключения ингибитором трипсина. В этих опытах Вамбутаса и Рэкера Са-активируемая АТФ-аза ингибировалась магнием и п-бутил-3,5-дииодо-4-гидробензоатом. Зато

было замечено, что этот фактор в неочищенных экстрактах более устойчив к холоду. Из остатка, полученного после экстракции фактора СФі из обработанных ацетоном хлоропластов, выделен

что выделенные из хлоропластов липиды частично поддерживают устойчивость против инактивации охлаждением фактора СФь Оказалось, что скорость инактивации СФі на холоду усиливалась при снижении рН и увеличении концентрации соли. По-види­ мому, при высокой ионной силе раствора происходит ослабление связей СФ] с мембранами до начала инкубации на холоду.

получил название СФ2 . Он чувствителен к обработке трипсином или к нагреванию и усиливает ФФ в хлоропластах, которые подвергались действию трипсина. В отсутствие АТФ раство­ римый СФі быстро инактивируется при температуре свыше60° С. Инкубацией хлоропластов в течение 10 мин при 80° С дости­ галась экстракция всей латентной АТФ-азы в раствор. Реадсорбция СФі происходит в присутствии катионов кальция или маг­ ния, но не одновалентных катионов.

Следующим шагом в изучении сопрягающего фактора явилось разделение хлоропластов и выделение из них двух фракций, совместное присутствие которых было необходимо для связы­ вания СФі [230]. Одна из фракций оказалась растворимой, а другая — нерастворимой в неводных растворителях. Растворимый компонент, выделенный из ацетонового экстракта хлоропластов, содержал белок, липид и хлорофилл. Действие хлороформа или бутанола инактивировало этот компонент. Наоборот, нераство­ римый компонент был выделен при обработке бутанолом.

таты исследований по разделению выделенных в водный со­ левой раствор ферментов, а именно:

осадки суспендировали и трижды промывали путем центрифуги­

причем в объединенные экстракты вносили буфер и восстано­ витель, как и при экстракции водою.

тельным насыщением солью, удаляли центрифугированием при 105 000 g, а супернатанты центрифугировали в градиенте плот­ ности 5—20%-ной сахарозы с добавлением дитиотреитол-трис- сульфатного буфера рН 8,0.

Все указанные выше ферменты содержались в экстрактах, и только половина Са-активируемой АТФ-азы оказалась в нера­ створимом осадке ламелл.

катализирующего обмен АТФ — АДФ, Mg-активируемой АТФ-азы

В ходе центрифугирования растворенных осадков в градиенте плотности сахарозы разделение пиков ферментов из фракции 50%-ного насыщения солью оказалось весьма нечетким. Лучшие результаты дало разделение методом гельэлектрофореза.

Авторы подчеркивали нестойкость АТФ-аз при их хранении даже Б течение нескольких часов, причем дитиотреитол активи­ рует Са-АТФ-азу, но не поддерживает ее активность. Последнее исследователь должен иметь в виду: хотя ЭДТА лучше стабили-

Отметим, что Mg-АТФ-аза на холоду более устойчива, но раз­ рушается трипсином.

Электронномикроскопические исследования обнаружили, что, во-первых, описанные ферменты не связаны с загрязнением хлоропластов митохондриями или другими органеллами, а, вовторых, термины «квантосома» и «препарат белков фракции I» относятся к части морфологически выявляемых на поверхности ламелл образований.

Аденилаткиназа проявляет определенное сходство с миокиназой тканей животных и характеризуется более высокой ста­

СФ для ФФ, хотя индуцируемые светом изменения рН или объ­ емов (конформационные изменения) не ингибировались. Это до­ казывало, что СФ не участвовал в индуцируемом светом изменении рН [692]. Кроме того, ранее было показано, что экст­ ракция хлоропластов растворами ЭДТА приводила к потере активности ФФ, зависимой от Са-АТФ-азы, а также инициируе­ мого светом увеличения рН и структурных изменений. Это бро­ сающееся в глаза противоречие было объяснено тем, что если СФ удаляют экстракцией растворами ЭДТА, то происходит наруше­ ние как структурной, так и каталитической, ферментативной функции этого вещества.

Зато при инактивации, вызванной действием антисыворотки, структурная функция, в отличие от ферментативной, остается ненарушенной. Согласно такой интерпретации, ферментативная функция СФ для осуществления индуцированных светом изме­ нений рН (см. ниже) или конформационных изменений не су­ щественна.

Попытка разобраться в такой двойственной природе действия

величины рН в подвергнутых экстракции ЭДТА хлоропластах, уменьшая скорость обратного изменения рН, было высказано

интермедиатов. Последнее может объяснить, почему Д Ц К Д сти­ мулирует ФФ в хлоропластах, которые утратили СФ. В ходе опытов было показано, что обработка хлоропластов ЭДТА при­ водила к экстракции 50—70% всей зависимой от кальция ак­ тивируемой трипсином АТФ-азы.

Маккарти и Рэкер [694] изучили влияние сопрягающего фак­ тора СФі на обратимость процесса ФФ. Высокие скорости актив­ ностей АТФ-азы, обмена неорганического меченого фосфора (Р 3 2 ) и АТФ и обращение электронного переноса от АТФ ха­ рактерны для митохондрий. Хотя сопрягающие факторы — так называемый Фі из митохондрий [115] и СФі из хлоропластов — проявляют определенные черты сходства, условия реакций с СФі несколько отличны. Для активации обмена Р 3 2 — АТФ и АТФ-аз- ных реакций в хлоропластах необходимо действие света или соединения с сульфгидрильными группами. Наиболее подходит здесь дитиотреитол. В реакциях принимает также участие АТФ-аза, активируемая ионами магния. В реакционные смеси вносили ФМС. Дитиотреитол активирует Mg-АТФ-азу в темноте, однако не активирует Са-АТФ-азу (условия активации которой описаны выше). Свет повышал активность Mg-активируемой АТФ-азы.

Кармели и Аврон [284], разбирая разногласия по вопросу действия разобщителей на Mg-зависимую АТФ-азу, высказали предположение, что как для этой АТФ-азы, так и для стиму­ ляции обмена АТФ — рН в хлоропластах «должны существовать условия высокоэнергетического состояния».

Последнее хорошо соответствует хемиосмотической гипотезе. Свет или дитиотреитол, поддерживая (или создавая) условия высокоэнергетического состояния, включают Mg-АТФ-азу.

Mg-АТФ-аза, включаемая светом, обладает замечательными свойствами: она гидролизует АТФ с высокой скоростью до нс-

черпывания резерва АТФ. Вероятно, поэтому АТФ выполняет двойную функцию, являясь субстратом для Mg-АТФ-азы и под­ держивая «состояние включения светом» этой АТФ-азы. Было показано, кроме того, что АТФ-аза может включаться кислотнощелочными переходами в присутствии сульфгидрильных соеди­ нений [571].

Физиологическое значение механизмов включения АТФ-азы может быть объяснено выработанным в ходе эволюции расти­ тельной клетки биохимическим приспособлением — сохранять АТФ в темноте [446].

Вообще говоря, роли высокоэнергетического состояния для ФФ в настоящее время уделяют большое внимание, и мы будем возвращаться к этому вопросу и в дальнейшем. По-видимому, оно может быть достигнуто как при действии света, так и при образовании высокоэнергетического интермедиата (ХЕ) дру­ гими путями, например при кислотно-щелочных переходах, а так­ же в присутствии пирофосфата или самого АТФ.

Прямое отношение к механизму ФФ имеют реакции обмена

терными для всех этих реакций являются зависимость их от действия света, концентрации ионов магния, высокоэнергетичных сульфгидрильных соединений, а также чувствительность ко многим разобщителям и ингибиторам ФФ.

единение, которое не стабильно в последующий темновой период и в отсутствие Ф п быстро разрушается, но является предшествен­ ником образования АТФ. Обсуждается роль пирофосфата в обмене с Фн . Пирофосфат стимулирует обмен АТФ — Ф н [881].

Роль сопрягающего фактора остается не выясненной до кон­ ца. Из данных лаборатории Рэкера [670] вытекает, что СФі является аллостерическим ферментом, имеющим каталитическую группу, реагирующую с адениннуклеотидами. По-видимому, этот белок находится в химическом взаимодействии с сульфо-, галакто- и фосфолипидами. Большой трудностью для изучения СФі яв­ ляется то, что в латентном состоянии СФі не проявляет свойств АТФ-азы, но все воздействия, которые приводят к его актива­ ции, вызывают растворение СФі, так что возможности изучать свойства СФі в нативном состоянии на структуре пока нет.

Маккарти и Рэкер [694] показали, что реакции обмена Ф н и АТФ, меченного по фосфату, чувствительны к одним и тем же ингибиторам, что и ФФ в целом.

Более того, антитело к СФі ингибирует все эти реакции, по­ этому все они входят в процесс ФФ. Развивая теоретические