книги из ГПНТБ / Эйнор Л.О. Реконструирование энергетических механизмов фотосинтеза

Поясним это подробнее. Частицы, осуществляющие сопря­ жение фосфорилирования с электронным переносом при фото­ синтезе (как и при дыхании), представляют замкнутые системы мембран. Митчелл подчеркивал, что фосфорилирующие частицы, полученные из хлоропластов при обработке ультразвуком или

детергентами, еще сохраняют та­ кую структуру [727]. Эти мем­ браны должны служить непрони­ цаемым или почти непроницае­ мым барьером для протонов. В мембране содержатся как фер­ менты транспорта электронов, так и АТФ-аза. Ферменты эти строго структурно упорядочены и четко ориентированы по отношению к

внутренней стороне), причем внутреннее пространство замкнутое. Представим себе, что в ходе реакций фотосинтеза имеет место восстановление переносчиков на разных уровнях транспор­ та электронов, а именно: связанного с белком марганца (уча­ ствующего в процессе разложения воды), меди пластоцианина, железа ферредоксина, железа гема цитохрома. Во всех этих

Компоненты ЭТЦ «перешнуровывают» мембрану и сопряже­ ны друг с другом строго упорядоченно, причем если каталити­ ческие центры тех из них, восстановление которых связано с

присоединением только электронов, находятся на внутренней стороне мембраны, а каталитические центры тех, которые свя­ заны с присоединением и электронов, и протонов, находятся на внешней стороне мембраны, то в итоге во внутреннем простран­ стве будут накапливаться протоны, а снаружи будет наблюдать­ ся их недостача (рис. 38). Соотношение в концентрациях ионов гидроксила будет обратным.

Транспорт электронов при фотосинтезе будет вести к соз­ данию градиента рН через мембрану. В принципе такой гра­ диент может поддерживаться не расходованием электронов и протонов, а образованием и передвижением отрицательно заря­ женных ионов гидроксила в противоположном по отношению к переносу протонов направлении или же одновременным ком­ бинированным движением всех этих и других заряженных частиц.

По гипотезе требуется жесткая, непроницаемая для свобод­ ного переноса протонов в обратном направлении, структура мем­ браны. Ступени, которые отражают передвижение протонов, являются по сути «местами» фосфорилирования. Хемиосмотическая гипотеза Митчелла в качестве предпосылки для осуществ­ ления процесса фосфорилирования требует наличия градиента рН или градиента заряда.

Величина г р а д и е н т а рН (АрН) должна зависеть от раз­ меров пула и буферной способности внутреннего пространства, тогда как г р а д и е н т п о т е н ц и а л а (АЕ) определяется электрическими свойствами мембраны. Более того, даже при уменьшенной скорости перемещения протонов в конечном итоге

том случае, если мембрана для них непроницаема.

Можно ожидать, что в определенных условиях, например при действии лизирующих мембрану веществ, утечка ионов уравно­ весит или парализует образование градиента.

Как же происходит образование АТФ? Митчелл формулирует свой постулат следующим образом: «Локализованные в мембра­ нах АТФ-азные системы митохондрий или хлоропластов являются водород-дегитратациоиными ферментами со специфичностью для воды и АТФ на конечном этапе, который завершает процесс»,— а их нормальными функциями являются обратимое сопряженней перенос протонов через мембрану с током ангидрид-связанных эквивалентов между водой и парой АТФ/(АДФ + ФН ) [727].

Поясним это. Фермент АТФ-аза, как известно, осуществляет реакцию

АТФ + Н 2 0 -> АДФ + Ф н .

Обратная реакция приводит к синтезу АТФ. Ферменты, принима­ ющие участие в фосфорилировании, «вставлены» в мембраны строго упорядоченно. Можно допустить (рис. 39), что ферменты

при действии на АТФ переносят электрондвижущую силу в про­ цессе разложения воды таким же образом, как и при осуще­ ствлении ЭТЦ. Здесь только действуют соответствующие (тоже строго пространственно локализованные) ферменты, которые со­ единяют протоны и ионы гидроксила, движущиеся в противо­ положных направлениях. Поэтому при переносе электрона по

при дыхании), что показано на рис. 40.

Циркуляция одного Н+, связанная с утилизацией определен­ ного количества атомов кислорода, вызывает синтез определен­ ного числа молекул АТФ [726] (АТФ/0->-Н+ ). Стехиометрическне отношения протона, перемещающегося через мембрану к синте­ зируемой молекуле АТФ при участии АТФ-азы или же пересече­ ние «мест сопряжения» электронами оказались при подсчетах сравнимыми с коэффициентом Р/О в рамках химической гипоте­ зы (для ОФ). Этот сложный вопрос нашел подтверждение в ис­ следованиях на системе цитохромоксидазы (на животной ткани)".

2. Скорость перемещения протонов в процессе окисления — восстановления может служить мерой синтеза АТФ.

Если перемещение протонов во время работы ЭТЦ направ­ лено «внутрь» мембран, то, наоборот, на каждую гидролизу-

емую молекулу АТФ приходится перенос «наружу» двух про­ тонов. В озвученных (но не обработанных дигитонином!) мито­ хондриях или хлоропластах передвижение протонов происходит в противоположном направлении в соответствии с морфологи­ ческой инверсией мембран. В последнем случае повреждение мембран и «уте'чка» протонов вследствие нарушения целостно­ сти мембран являются препятствием для точных расчетов.

3. Роль разобщителей (например, 2,4-ДНФ) сводится к «ко­ роткому замыканию». Подробнее на объяснении действия разобщителей мы остановимся ниже (см. стр. 198).

Так как накопление экспериментальных данных внесло боль­ шие трудности в объяснение полученных отношений Р/Н+, если учитывать один лишь протонный потенциал, Митчеллом были внесены существенные коррективы в тот вариант хемиосмотической концепции, который был выдвинут в 1966 г. [727]. Заметим, что гипотеза Митчелла в процессе своего развития стала более «терпимой» к существованию высокоэнергетичных интермедиатов. Цикл реакций, связанных с АТФ-азой, осуще­

жения. Митчелл пришел к заключению, что градиент трансмем­ бранного электрохимического потенциала имеет две составляю­ щие: концентрационный градиент протонов Н+ и потенциал элект­ ростатического заряда АЕ, пересекающий плоскость мембраны.

Для объяснения фосфорилирования, наблюдаемого в отсут­ ствие переноса протонов, было выдвинуто предположение о су­ ществовании независимого электрофоретического фактора АЕ. Например, Маккарти [689] в 1968 г. установил, что частицы, полученные озвучиванием хлоропластов в присутствии хлори­ стого аммония или антибиотика нигерицина и ионов калия, еще способны образовывать АТФ, хотя не обнаруживают способ­ ности к переносу протонов.

Митчелл [729] объяснял эти и другие более поздние экспери­ ментальные данные об отсутствии индуцируемых светом сдвигов рН при сохранении способности к фосфорилированию в обра­ ботанных дигитонином хлоропластах [755, 759, 753, 750] нали­ чием АЕ как независимой движущей силы образования АТФ. Однако такое объяснение означает существенный отход от пер­ воначального варианта хемиосмотической теории. Кроме того, введение электрофоретического фактора АЕ ставит вопрос о переносе протона через мембрану как вторичном, второстепен­ ном биоэнергетическом процессе. Необходимо также рас­

гипотезой, не носят конкретного характера (например, [543])'. Однако для сохранения такого соответствия представляется логи­ чески необходимым, чтобы ферменты, связанные с поглощением протона, последовательно чередовались с ферментами, при вос­ становлении которых присоединяется trH++OH только электрон. Дать доказательства такой последовательности работы пе­

шреносчиков для полной цепи ФФ от

следует рассматривать как обязательный процесс, сопровождаю­ щий транспорт электронов при фосфорилировании.

Уже отмечалось, что легкие фракции (144 ООО g или 160 000g), выделенные после озвучивания хлоропластов [540] или продавливания их в прессе Френча [843] из межгранных ламелл, отличаются высоким отношением Хл а/Хл b и обнаруживают активность только ФС-І [843, 722].

Можно допустить, что, согласно схеме ЭТЦ Кнаффа и Ар­ нона, эти фракции содержат ПБЛВ-комплексы, включающиеавтономную ФС-І, действующую параллельно ФС-П, локализо­ ванной в ламеллах гран. В соответствии с вышесказанным, тя­ желые фракции из гран должны обнаружить протонный гра­ диент, а легкие фракции из ламелл стромы не должны его об­ наруживать, выявляя в то же время ЦФФ. Одновременно отно­ сительная нечувствительность ЦФФ к разобщающему действию хлористого аммония, как было показано Крофтсом [324], может

данные по изменениям спектров пигментов у фотосинтезирующих объектов, в определенной степени объясняющие образо­ вание электростатического потенциала и связь его с переносом протонов и ионов через мембраны. С помощью уникальных бы­ стродействующих спектрофотометров проанализированы много­ численные дифференциальные спектры в области 200—800 нм при возбуждении объектов (хлоропластов шпината или суспен­ зии хлореллы) вспышками света, в том числе и от рубинового лазера, через некоторые периоды времени после импульсов света различной продолжительности. Получена информация по кине­ тике изменений, которые эти исследователи относят к измене­ ниям разных форм Хл а и Хл Ь, цитохромов, Пх, П700 и т. д.

Анализ дифференциальных спектров с разрешением во време­ ни Ю - 8 сек привел Витта с соавт. к логическому объединению из­ менений, связанных с метастабильным состоянием, световыми ре­ акциями, электронными переносами, образованием электрическо­ го поля и переносом протонов и ионов через мембраны (рис. 42).

Наблюдения над очень быстрыми изменениями при 700,682' и 438 нм привели к представлениям об окислительно-восстанови­ тельных реакциях с вовлечением двух молекул Хл а на реакци­

максимумами поглощения при 682 и 435 нм. Они исследованы, хуже. Следует подчеркнуть, что изменения в поглощении, отно­ сящиеся к отдельным компонентам, характеризуются довольно резкими отличиями в продолжительности релаксации (полу­ распада). Были выделены изменения, характерные для образо­ вания метастабильного состояния (при 520 нм), для переносов электрона, а также для электрического поля и перемещений ионов.

Время образования электрического поля меньше или равно 2 - Ю - 8 сек [1005]. Предполагается такая последовательность со­ бытий. При действии короткой вспышки света в каждой из двух фотосистем индуцируется исключительно быстрый электронный сдвиг, приводящий к разделению зарядов внутри реакционных центров. Важно, что это приводит к образованию электричес­ кого поля через мембрану. Процессы изучают по изменениям'

Иначе говоря, восстановление акцептора А ФС-І сопряжено с пе­ ремещением двух ионов водорода из внешней фазы. Таким обра-

зом, последовательный перенос двух электронов от акцептора со­ пряжен с передвижением четырех протонов, что дает отношение ДН+ /Де~ = 2, в соответствии с экспериментальными данными. Пе­ ремещение протонов внутрь создает мембранный потенциал, кото­ рый заменяет потенциал, обусловленный первоначальным сдви­ гом электронов. В ходе продолжительного освещения перемеще­ ние протонов во внутреннюю фазу протекает очень медленно, за время, измеряемое секундами. При этом протоны обмениваются на другие ионы в соответствии с мембранным потенциалом. Отток протонов в темноте разрушает поле [852, 559].

Рост абсорбционных изменений вслед за освещением суспен­ зий хлоропластов или хлореллы короткой мощной вспышкой света протекает очень быстро — менее чем за 2 • 10~8 сек; распад, возвращение к исходному уровню происходит значительно мед­ леннее ( 5 - Ю - 3 — 2 - Ю - 2 сек) и зависит от различных физиоло­ гических условий (рН, температуры, наличия кофакторов фосфо­ рилирования, присутствия разобщителей и т. д.). В период тем­ ноты после вспышки света, мембрана может быть разряжена пересекающим потоком ионов, который определяется конкрет­ ными условиями ионной проводимости, зависящими от ука­ занных выше условий. Индикатором силы электрического поля служат абсорбционные изменения Хл Ъ [560].

Усиление распада поля через мембрану связывается с умень­ шением изменений поглощения при 515 нм. Ожидаемый эффект наблюдался при увеличении мембранной проницаемости для ионов, которая увеличивалась при помещении лишенных оболо­ чек хлоропластов в гипоили гипертонические среды. Если на­ блюдавшееся усиление изменений абсорбции Хл Ъ вызвано уве­ личением проницаемости для ионов, что предусмотрено в мо­ дели, и если движущиеся в поле ионы подчиняются, пусть даже приблизительно, уравнению Нернста—Планка, следовало бы ожидать, что при увеличении концентрации проникающих ионов распад может быть еще более ускорен. И в действительности

В результате опытов с искусственными мембранами были вы­ двинуты определенные гипотезы о механизме действия анти­ биотиков типа грамицидина, создающего проводимость для ионов щелочных металлов. В лаборатории Витта показано, что

сти электронного транспорта при увеличении скорости фосфори­ лирования посредством изменений концентраций Фн . Так как ско­ рость электронного транспорта зависит от скорости оттока про­ тонов [827], можно заключить, что фосфорилирование вызьщает

дополнительную проницаемость для протонов в тилакоидной мембране, а отток протонов через мембрану усиливает дополни­

если же происходит фосфорилирование, то возникает дополни­ тельный ток протонов. Это делает весьма вероятным допущение, что необходимая для фосфорилирования энергия может быть получена, по меньшей мере частично, из энергии, сохраняемой в электрическом поле. Энергия может расходоваться на переме­ щение протонов посредством анизотропной АТФ-азы, как было постулировано Митчеллом.

Юнге с соавт. [559] показали, что уровень поглощения при 515 и 705 нм в ответ на быстрые вспышки изменяется пропор­ ционально активности ФС-1 и ФС-П. Инактивация ФС-П диуроном приводит к торможению изменений при 515 нм, но не при 705 нм, где поглощение остается без изменений.

Влаборатории Витта был рассмотрен вопрос о функциональ­ ной единице фотосинтеза, объединяющей такие происходящие при фотосинтезе явления, которые приводят к образованию ассими­ лирующей силы. Мембрана, на которой разыгрываются эти явле­ ния, должна иметь по меньшей мере размеры 5000 X 5000 А , что соответствует тилакоидной мембране, поэтому Витте соавт. счита­ ют функциональной единицей фотосинтеза один тилакоид [1005].

Вчасти I приводились доказательства Эмерсона и Арнольда существования ФЕ. Если учесть, что площадь, занимаемая 300 молекулами хлорофилла, составляет 300Х300А, то оказывается,

что функциональная единица фотосинтеза — тилакоид — содер­ жит несколько сот ЭТЦ. Величина изменения электрического поля, пересекающего мембрану при коротких вспышках света

стоянии 3 [729].

Все сказанное выше относительно гипотезы Митчелла и ее дальнейшего развития позволяет сделать вывод, что градиент протонов возникает лишь в определенных условиях, а образо­ вание АТФ за счет расходования этого градиента происходит только в части случаев. По-видимому, в цепи переноса электрона при ЦФФ действуют иные механизмы синтеза АТФ.

Помимо рассмотренной только что концепции хемиосмотической гипотезы, которая в первоначальном варианте носила сугубо антагонистический характер по отношению к химическим

гипотезам сопряжения, выдвинуты и другие гипотезы механиз­ мов образования АТФ.

Ясников с соавт. [161] предложил оригинальную гипотезу относительно природы «протонного насоса», согласно которой

низма передачи фосфата его акцепторам от енолфосфата под влиянием электрофильных агентов.

Ацетолфосфат и фосфоенолпируват вводили в качестве до­

ческого предшественника ХЕ имеют сходство с этим естествен­ ным промежуточным продуктом, причем в предполагаемом цик­ лическом процессе, с участием ХЕ на одной из стадий, необхо­ димо присоединение протона. Ацетолфосфат может быть включен в систему ФФ путем превращения его в соединение, содержащее енолфосфатную группу, которое может образовываться при кон­ денсации ацетолфосфата с карбонильной группой кофермента ФФ, а затем вступает в цикл фосфорилирования с переходом фосфатной группы на АДФ и образованием дикетона.

На следующей стадии восстанавливается дикетон, в резуль­ тате чего возникает эпоксисоединение, которое служит акцеп­ тором Фи . Присоединение Ф н и дегидрогенирование промежуточ­ ного продукта приводят систему в исходное состояние. На при­ веденной схеме из работы [161] показан енблфосфатный цикл образования АТФ.